クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降（ChIP）とは

クロマチン免疫沈降（Chromatin immunoprecipitation、略称ChIP）は、細胞内で特定のタンパク質がどのDNA配列に結合しているのかを明らかにするための重要な分子生物学的手法です。特に、転写因子やヒストン修飾酵素といった、遺伝子の発現制御に関わるタンパク質が、ゲノム上のどの領域で機能しているかを調べる際に威力を発揮します。この方法は、目的のタンパク質を特異的に認識する抗体を利用して、そのタンパク質が結合しているDNA断片を選択的に回収することで、その相互作用を解析します。

これまでの同様の手法と比較すると、例えばゲルシフトアッセイのように無細胞系（in vitro、細胞成分を抽出した溶液中）で特定のDNA配列に結合するタンパク質を探すのに対し、ChIPは生きた細胞内（in vivo）の状態を反映できるのが大きな特徴です。タンパク質を起点として、細胞本来の状態に近い環境で結合するDNA配列を特定できるため、より生理的な状況での相互作用を捉えることが可能です。

解析の基本的な流れ

ChIP解析は、主に以下のステップを経て行われます。

1. タンパク質とDNAの結合固定（クロスリンク）：まず、生きた細胞内でタンパク質がDNAに結合した状態を固定するため、ホルムアルデヒドなどの架橋剤を用いてタンパク質とDNAを共有結合で結びつけます。これにより、その後の操作中に結合が外れるのを防ぎます。

2. 細胞溶解とDNAの断片化：固定化された細胞からDNAを抽出した後、DNAを適切な長さに断片化します。この断片化は、制限酵素を用いたり、超音波処理（ソニケーション）を行ったりすることで実現します。こうして、タンパク質が結合したままの短いDNA断片群を得ます。

3. 抗体を用いた免疫沈降：目的のタンパク質に対する特異的な抗体を加えます。この抗体は、タンパク質に結合し、そのタンパク質が結合しているDNA断片を含む複合体（DNA-タンパク質-抗体複合体）を形成します。

4. 複合体の回収と洗浄：抗体に結合した複合体を、アガロースビーズや磁気ビーズなどを利用して溶液中から分離し、沈殿させます。この際、目的のタンパク質が結合していない他のDNA断片は溶液中に残るため、これを取り除くために洗浄を行います。

5. 結合DNAの遊離と回収：回収した複合体から、クロスリンクを解除したり、プロテイナーゼKなどの酵素でタンパク質を分解したりすることで、結合していたDNA断片のみを遊離させます。こうして、目的のタンパク質が細胞内で実際に結合していたゲノム上の短いDNA配列を選択的に回収することができます。

結合DNA断片の同定

回収されたDNA断片がゲノム上のどこに位置するのか、どのような配列を持つのかを明らかにするのが次の重要なステップです。これにより、目的のタンパク質が結合する具体的な遺伝子領域や調節配列を特定したり、未知の標的遺伝子を発見したりすることが可能になります。

初期のChIP解析では、配列が事前に予想されている特定の領域について、回収したDNA断片がその領域に存在するのかをPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によって確認する方法が一般的でした。しかし、この方法は網羅性に欠けるという限界がありました。

より広範な解析を可能にしたのが、「ChIP on chip」と呼ばれる手法です。これは、回収したDNA断片をDNAチップ（マイクロアレイ）にハイブリダイズさせることで、一度に数千から数万もの既知のDNA配列に対して結合の有無を検証できるものです。これにより、目的タンパク質のゲノム全体での結合パターンをある程度把握できるようになりました。

さらに現在主流となっているのが「ChIP-seq」です。これは、回収したDNA断片を次世代DNAシークエンサーを用いて直接的に配列決定する手法です。ChIP-seqでは、既知の配列だけでなく、予測していなかった未知の結合部位も高解像度かつ網羅的に特定できます。特定の転写因子が結合するエンハンサー領域やプロモーター領域、あるいはヒストン修飾が存在する領域などをゲノムワイドに解析するために、ChIP-seqは不可欠なツールとなっています。

まとめ

クロマチン免疫沈降法は、生細胞内でのDNA-タンパク質相互作用を分子レベルで解析するための強力な技術であり、遺伝子発現制御機構、エピジェネティクス、DNA複製、修復など、生命現象の根幹に関わる様々な研究分野で利用されています。特にChIP-seqの登場により、その解析能力は飛躍的に向上し、ゲノム機能の理解を深める上で欠かせない手法となっています。

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