フォイルゲン染色

フォイルゲン染色 (Feulgen staining)

フォイルゲン染色は、生体組織や細胞標本中に存在するデオキシリボ核酸（DNA）を特異的に識別するための、古典的でありながら極めて重要な組織化学的技法です。この方法は1924年、ドイツの科学者ロベルト・フォイルゲン（Robert Feulgen）によって開発されました。細胞の核に存在するDNAの局在を明らかにするだけでなく、その量を半定量的に評価することも可能な点が特徴です。

原理

フォイルゲン染色の核となる原理は、DNA分子に特有の化学反応に基づいています。

1. 酸加水分解: 試料を比較的穏やかな条件下で希塩酸（一般的には1規定、60℃）により処理します。この酸処理によって、DNAを構成するデオキシリボース糖とプリン塩基（アデニン、グアニン）を結ぶN-グリコシド結合が選択的に加水分解されます。ピリミジン塩基（シトシン、チミン）との結合は、この条件下では比較的安定です。この加水分解の結果、デオキシリボース糖が開環し、特定のアルデヒド基が遊離して露出します。

2. シッフ反応: 次に、試料をシッフ試薬（Schiff's reagent）と反応させます。シッフ試薬は、塩基性フクシンという赤紫色の色素を亜硫酸で処理して脱色した無色の溶液（亜硫酸フクシン）です。この試薬中の無色の化合物が、酸加水分解によってDNAから遊離したアルデヒド基と特異的に反応します。アルデヒド基との反応により、再びキノイド構造が形成され、元の塩基性フクシンに由来する鮮やかな赤紫色が発色します。

この一連の反応により、細胞内のDNAが存在する部位、すなわち主に核が特徴的な赤紫色に染色されるのです。

手順と留意点

フォイルゲン染色を実施する際にはいくつかの重要な点があります。

固定: この染色法はDNAの酸加水分解に依存するため、ホルマリンなどのアルデヒド系固定剤による固定は問題ありませんが、強酸を用いた固定法（例えば、ブアン固定液など）はDNAを加水分解しすぎる可能性があるため避けるべきです。
加水分解: 典型的な手順では、試料を60℃の1規定塩酸中に置きます。この温度と酸濃度、そして処理時間は、DNA以外の細胞成分への影響を最小限に抑えつつ、DNAの加水分解を最適に行うために調整されています。
シッフ試薬処理: 加水分解後、試料をシッフ試薬に浸漬します。反応時間は数十分から数時間かかる場合があります。
洗浄: 従来のプロトコルでは、シッフ試薬処理後に亜硫酸水で洗浄する工程が含まれていましたが、現代の研究ではこの工程は必須ではない、あるいは不必要であるとされています。
* 対比染色: 核の赤紫色を見やすくするため、細胞質などを異なる色で染色する対比染色が行われることがあります。緑色のライトグリーンSFなどが用いられる代表的な対比染色剤です。

定量的応用と生物学への貢献

フォイルゲン反応は、その原理上、遊離するアルデヒド基の数がDNAの量に比例すると期待できるため、単なる形態観察にとどまらず、細胞ごとのDNA含量を測定するための手段としても利用されてきました。理論的には、細胞内にDNA加水分解以外にアルデヒド基を生じる物質がなければ、反応は定量的になります。実際には微細な構造物からの散乱や他の微量な反応の可能性もゼロではないため、「半定量的」と称されることが多いですが、適切な条件下では極めて精度の高い定量が可能です。

フォイルゲン染色によって生じた色素量を、ミクロデンシトメーターや顕微分光光度計といった専用の機器を用いて測定することにより、個々の細胞が持つDNAの相対量や絶対量を算出することができます。この技術は、細胞周期の研究において画期的な貢献をしました。細胞が分裂するまでの間期は、光学顕微鏡では静止しているように見えますが、フォイルゲン染色によるDNA量の測定によって、見かけ上同じ間期にある細胞でもDNA含量が2倍になっている集団が存在することが明らかになったのです。これはDNA複製が行われている時期（S期）の存在を示唆し、その後の研究で間期がさらにG1期（DNA合成準備期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂準備期）の三つの段階に細分化される重要な根拠の一つとなりました。

このように、フォイルゲン染色はDNAの視覚化だけでなく、細胞周期の理解を深める上でも歴史的に極めて大きな役割を果たした手法であり、現在でも教育や研究の現場で利用されています。

もう一度検索