ブルー・ホワイトセレクション

ブルー・ホワイトセレクション（Blue–white screen）は、分子クローニング実験において、目的のDNA断片が正しくベクターに組み込まれた（組換え体）細菌を、多数の細胞の中から視覚的に迅速かつ簡便に選別するための強力なスクリーニング技術です。この手法を用いることで、クローニングに成功した組換え体を効率的に見つけ出すことができます。

背景と原理

分子クローニングでは、目的の遺伝子断片をプラスミドなどのベクターに連結（ライゲーション）し、そのベクターを細菌などの宿主細胞に導入する（形質転換）ことで、目的の遺伝子を増幅・解析します。しかし、ライゲーションの際に目的の断片がベクターに挿入されない（非組換え）場合や、ベクターが切断されずに残る場合などがあり、形質転換されたすべての細胞が目的の組換え体を含んでいるわけではありません。多くのコロニーの中から目的の組換え体を含むものだけを一つずつ選んで解析する作業は、非常に時間と労力がかかるため、これを効率化する手法としてブルー・ホワイトセレクションが開発されました。

この技術は、β-ガラクトシダーゼという酵素の機能回復に関わるα相補性という現象に基づいています。β-ガラクトシダーゼの一部が欠損して不活性になったとしても、別の特定のペプチド断片（α-ペプチド）が存在することで、酵素の機能が回復することがあります。この原理が、分子クローニングベクターに応用されました。特に、メッシングらによって開発されたpUCシリーズのようなプラスミドベクターは、このスクリーニング法のために設計されています。

分子機構

ブルー・ホワイトセレクションでは、β-ガラクトシダーゼのα相補性が利用されます。宿主となる大腸菌株は、機能的なβ-ガラクトシダーゼを作るための_lacZ_遺伝子の一部が欠損した変異体（_lacZΔM15_）を持っています。一方、クローニングに用いるベクターには、_lacZ_遺伝子のN末端部分をコードする_lacZα_配列が含まれています。_lacZΔM15_を持つ宿主細胞に_lacZα_を含むベクターが導入されると、両者から作られるペプチドが細胞内で協力し、機能的なβ-ガラクトシダーゼ酵素が再構成されます。

このベクターの_lacZα_配列の中には、外来DNAを挿入するための様々な制限酵素認識サイトが集まったマルチクローニングサイト（MCS）があります。目的のDNA断片をこのMCS内に挿入するために制限酵素で切断し、ライゲーションを行います。目的DNAがMCS内に挿入されると、_lacZα_遺伝子の読み枠がずれたり破壊されたりするため、正常なα-ペプチドが作られなくなり、α相補性が阻害されます。結果として、機能的なβ-ガラクトシダーゼは生成されません。

形質転換された細胞は、β-ガラクトシダーゼの基質であるX-galを含む寒天培地で培養されます。X-galは無色ですが、機能的なβ-ガラクトシダーゼによって分解されると、青色の不溶性色素を生成します。

したがって、

インサートを含まない非組換えプラスミドを持つ細胞は、_lacZα_遺伝子が正常で機能的なβ-ガラクトシダーゼが作られるため、X-galを分解して青いコロニーを形成します。
目的DNAが挿入された組換えプラスミドを持つ細胞は、_lacZα_遺伝子が破壊されて機能的なβ-ガラクトシダーゼが作られないため、X-galは分解されず、白いコロニーを形成します。

研究者は、このコロニーの色を手がかりに、目的の組換え体である可能性が高い白いコロニーを選び出し、その後の解析に進みます。

実施上の注意点と欠点

ブルー・ホワイトセレクションを正確に行うためには、適切なベクター（_lacZα_とMCSを含む）と宿主細胞（_lacZΔM15_変異を持つ）の組み合わせが重要です。pUC19などのベクターと、JM109やDH5αなどの宿主菌株が一般的です。培地はグルコースを含まないものを用い、必要に応じてIPTGのような誘導剤を添加することもあります。X-galは光に弱い性質があるため、保管には注意が必要です。

この方法は簡便である反面、限界もあります。白いコロニーの中にも、実際には目的の組換えプラスミドを含んでいない場合があります。例えば、ライゲーションが不正確であったり、ベクターが再環状化したり、あるいは_lacZα_遺伝子に変異が入ったりした場合などが考えられます。また、ベクターを持たない細胞が、抗生物質を含む培地で選択されたコロニーの周囲に小さなサテライトコロニーとして増殖し、白く見えることもあります。

逆に、青いコロニーの中にも組換え体が含まれている可能性がわずかにあります。これは、挿入されたDNA断片が_lacZα_遺伝子の読み枠（フレーム）と合致し、機能を持つ融合タンパク質が偶然生成された場合などに起こり得ます。また、コロニーの色の濃淡で判断が難しいケースも見られます。

これらの理由から、ブルー・ホワイトセレクションで選別したコロニーについても、目的の組換え体であるかどうかを最終的に確認するために、プラスミドDNA抽出後の制限酵素解析やDNAシークエンスなどの追加的な解析を行うことが強く推奨されます。近年では、X-galの代わりにGFP（緑色蛍光タンパク質）を利用したスクリーニング法など、代替技術も開発されています。

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