固定 (組織学)
生物学や医学の研究、あるいは検査において、細胞や組織といった生体試料の詳細な構造を観察することは不可欠です。しかし、生きたままの状態では時間とともに自己分解が進み、また外部からの微生物による影響を受けて容易に変質してしまいます。そこで行われるのが「固定」と呼ばれる処理です。
固定の主な目的は、試料が持つ生命現象を任意の瞬間に止め、その構造を可能な限り生きている時に近い状態で保全することです。これにより、試料は自身の酵素による分解（自己分解）や、細菌などの活動による腐敗から守られます。また、その後の観察や操作に耐えうる物理的な強度や化学的な安定性を試料に与えることも目的の一つです。
固定された試料は、顕微鏡で観察するための標本として長期間保存が可能となります。さらに、固定はその後に行われる重要な工程、例えば試料を樹脂などで固める「包埋」、薄く切り出す「切片作成」、特定の構造を識別しやすくするための「染色」といった作業をスムーズに進めるための準備でもあります。
固定のメカニズムは主に、試料を構成するタンパク質を変化させる（変性させる）ことにあります。これにより、生命活動の要である酵素の働きが失われ、細胞内のゾル状だった原形質が固化して形態が保たれるのです。この目的を達成するために、大きく二つの方法が用いられます。
1. 化学固定: 特定の化学物質（固定剤）を用いて、試料の分子構造に作用させる方法です。最も一般的で、様々な種類の固定剤が存在します。
架橋固定: 分子間に共有結合を形成させることで、特にタンパク質を強固に結びつけ、構造を安定させます。アルデヒド類（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）や酸化剤（四酸化オスミウムなど）がこれにあたります。アルデヒドは広く使われ、ホルムアルデヒドは組織学で頻用されます。グルタルアルデヒドはより強力な固定力を持つため、電子顕微鏡用の固定によく使われます。四酸化オスミウムは脂質も固定できるため、細胞膜構造の維持に有効で、電子顕微鏡観察に重要ですが、光学顕微鏡や免疫組織化学には向きません。
析出固定: タンパク質の溶解度を低下させたり、分子間の弱い結合（疎水結合など）を壊したりすることで、タンパク質を凝集・沈殿させて固定する方法です。アルコール類（エタノール、メタノール）、アセトン、酢酸などが利用されます。これらの有機溶媒はタンパク質を変性・不活化させますが、組織を収縮させやすい性質を持ちます。
2. 物理固定: 化学物質ではなく、物理的な変化を利用する方法です。代表的なものに、試料を急速に凍結させる方法や、熱を加える方法があります。凍結固定では、氷の結晶形成による構造破壊を防ぐため、凍結したまま溶媒で水分を置き換える凍結置換法がよく行われます。塗抹標本など、ごく簡単な固定には火炎による熱固定が用いられることもあります。
試料を固定液に接触させる主要な方法には、以下の二つがあります。
1. 浸漬法（Immersion Fixation）: 試料全体を固定液に浸す最も基本的な方法です。組織の大きさや密度に応じて固定液の浸透に時間がかかるため、ある程度の大きさの試料では中心部まで固定剤が到達するのに時間がかかります。広範な試料に適用可能です。
2. 灌流法（Perfusion Fixation）: 循環系を持つ動物に対し、血管を通じて固定液を全身に送る方法です。固定液が瞬時に体の隅々まで行き渡るため、組織が生きた状態に近いまま固定されるという利点があります。しかし、動物を死亡させることや、大量の固定液を必要とする点が課題です。
固定に用いられる化学物質を単独で使う場合もあれば、複数の固定剤を組み合わせて用いる場合もあります。後者は複合固定液と呼ばれ、それぞれの固定剤の欠点を補い合ってより良好な結果を得るために広く用いられます。また、固定液には、pHを安定させる緩衝剤や、浸透圧・粘度を調整する塩類などが加えられることもあります。
複合固定液の例としては、光学顕微鏡観察に頻用されるブアン液（ピクリン酸、ホルマリン、酢酸の混合）、植物組織によく使われるFAA液（ホルマリン、酢酸、アルコール）、特定動物に用いるAFA液などがあります。中性ホルマリンは、ホルマリンから生じる酸によって試料が溶解するのを防ぐため、炭酸カルシウムを持つ生物などに使われます。
最適な固定法は、観察したい生物の種類、組織の性質、そして研究や検査の目的に応じて慎重に選ばれます。例えば、魚類は体表の粘液を除去し、形態を保ってホルマリン固定することが多いですが、大型個体には内部への固定液注入が必要です。海綿動物やイソギンチャクなどの水分が多い大型の無脊椎動物には濃度の高いホルマリン海水が、炭酸カルシウムを骨格に持つ動物にはアルコール固定や中性ホルマリンが適しています。一方、クラゲのようなゼラチン質でできた生物はアルコールで溶解してしまうため、ホルマリン固定が必須となります。
組織学における固定法の発展は、顕微鏡技術の進歩とともに進んできました。18世紀後半にアルコール固定が発明された後、19世紀にはクロム酸、四酸化オスミウムといった新しい固定剤や、凍結切片、パラフィン切片などの標本作成技術が登場しました。特に1893年にホルマリンが固定剤として導入されたことは、その後の組織学研究に大きな影響を与えました。
適切な固定は、その後のあらゆる形態観察や分子解析の信頼性を左右する極めて重要な最初のステップと言えます。そのため、試料の特性や目的に合った固定法を選択し、適切に実施することが不可欠です。しかし、どんな優れた固定法を用いても、人工的な処理である以上、生体にはない構造（人工産物）を生じる可能性があり、結果を評価する際にはこの点を理解しておくことが重要です。
固定の主な目的は、試料が持つ生命現象を任意の瞬間に止め、その構造を可能な限り生きている時に近い状態で保全することです。これにより、試料は自身の酵素による分解（自己分解）や、細菌などの活動による腐敗から守られます。また、その後の観察や操作に耐えうる物理的な強度や化学的な安定性を試料に与えることも目的の一つです。
固定された試料は、顕微鏡で観察するための標本として長期間保存が可能となります。さらに、固定はその後に行われる重要な工程、例えば試料を樹脂などで固める「包埋」、薄く切り出す「切片作成」、特定の構造を識別しやすくするための「染色」といった作業をスムーズに進めるための準備でもあります。
固定の原理と方法
固定のメカニズムは主に、試料を構成するタンパク質を変化させる（変性させる）ことにあります。これにより、生命活動の要である酵素の働きが失われ、細胞内のゾル状だった原形質が固化して形態が保たれるのです。この目的を達成するために、大きく二つの方法が用いられます。
1. 化学固定: 特定の化学物質（固定剤）を用いて、試料の分子構造に作用させる方法です。最も一般的で、様々な種類の固定剤が存在します。
架橋固定: 分子間に共有結合を形成させることで、特にタンパク質を強固に結びつけ、構造を安定させます。アルデヒド類（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）や酸化剤（四酸化オスミウムなど）がこれにあたります。アルデヒドは広く使われ、ホルムアルデヒドは組織学で頻用されます。グルタルアルデヒドはより強力な固定力を持つため、電子顕微鏡用の固定によく使われます。四酸化オスミウムは脂質も固定できるため、細胞膜構造の維持に有効で、電子顕微鏡観察に重要ですが、光学顕微鏡や免疫組織化学には向きません。
析出固定: タンパク質の溶解度を低下させたり、分子間の弱い結合（疎水結合など）を壊したりすることで、タンパク質を凝集・沈殿させて固定する方法です。アルコール類（エタノール、メタノール）、アセトン、酢酸などが利用されます。これらの有機溶媒はタンパク質を変性・不活化させますが、組織を収縮させやすい性質を持ちます。
2. 物理固定: 化学物質ではなく、物理的な変化を利用する方法です。代表的なものに、試料を急速に凍結させる方法や、熱を加える方法があります。凍結固定では、氷の結晶形成による構造破壊を防ぐため、凍結したまま溶媒で水分を置き換える凍結置換法がよく行われます。塗抹標本など、ごく簡単な固定には火炎による熱固定が用いられることもあります。
固定の手法
試料を固定液に接触させる主要な方法には、以下の二つがあります。
1. 浸漬法（Immersion Fixation）: 試料全体を固定液に浸す最も基本的な方法です。組織の大きさや密度に応じて固定液の浸透に時間がかかるため、ある程度の大きさの試料では中心部まで固定剤が到達するのに時間がかかります。広範な試料に適用可能です。
2. 灌流法（Perfusion Fixation）: 循環系を持つ動物に対し、血管を通じて固定液を全身に送る方法です。固定液が瞬時に体の隅々まで行き渡るため、組織が生きた状態に近いまま固定されるという利点があります。しかし、動物を死亡させることや、大量の固定液を必要とする点が課題です。
固定液の種類
固定に用いられる化学物質を単独で使う場合もあれば、複数の固定剤を組み合わせて用いる場合もあります。後者は複合固定液と呼ばれ、それぞれの固定剤の欠点を補い合ってより良好な結果を得るために広く用いられます。また、固定液には、pHを安定させる緩衝剤や、浸透圧・粘度を調整する塩類などが加えられることもあります。
複合固定液の例としては、光学顕微鏡観察に頻用されるブアン液（ピクリン酸、ホルマリン、酢酸の混合）、植物組織によく使われるFAA液（ホルマリン、酢酸、アルコール）、特定動物に用いるAFA液などがあります。中性ホルマリンは、ホルマリンから生じる酸によって試料が溶解するのを防ぐため、炭酸カルシウムを持つ生物などに使われます。
生物種と固定法の選択
最適な固定法は、観察したい生物の種類、組織の性質、そして研究や検査の目的に応じて慎重に選ばれます。例えば、魚類は体表の粘液を除去し、形態を保ってホルマリン固定することが多いですが、大型個体には内部への固定液注入が必要です。海綿動物やイソギンチャクなどの水分が多い大型の無脊椎動物には濃度の高いホルマリン海水が、炭酸カルシウムを骨格に持つ動物にはアルコール固定や中性ホルマリンが適しています。一方、クラゲのようなゼラチン質でできた生物はアルコールで溶解してしまうため、ホルマリン固定が必須となります。
歴史的背景
組織学における固定法の発展は、顕微鏡技術の進歩とともに進んできました。18世紀後半にアルコール固定が発明された後、19世紀にはクロム酸、四酸化オスミウムといった新しい固定剤や、凍結切片、パラフィン切片などの標本作成技術が登場しました。特に1893年にホルマリンが固定剤として導入されたことは、その後の組織学研究に大きな影響を与えました。
適切な固定は、その後のあらゆる形態観察や分子解析の信頼性を左右する極めて重要な最初のステップと言えます。そのため、試料の特性や目的に合った固定法を選択し、適切に実施することが不可欠です。しかし、どんな優れた固定法を用いても、人工的な処理である以上、生体にはない構造（人工産物）を生じる可能性があり、結果を評価する際にはこの点を理解しておくことが重要です。
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