赤血球凝集試験

赤血球凝集試験（HA）および血球凝集阻止試験（HI）

赤血球凝集試験（Hemagglutination Assay、略称HA）および血球凝集阻止試験（Hemagglutination Inhibition Assay、略称HI）は、特定のウイルスや細菌、あるいはそれらに対する抗体の相対的な量を測定するために用いられる生化学的なアッセイです。これらの手法は、1941年から1942年にかけてアメリカのウイルス学者ジョージ・ハーストによって開発され、特にインフルエンザウイルス研究において歴史的に重要な役割を果たしてきました。HAとHIは、赤血球が特定の因子によって凝集する現象、すなわち赤血球凝集反応を原理としています。

この反応は、インフルエンザウイルスなどの表面にあるヘマグルチニンと呼ばれる糖タンパク質が、赤血球表面に存在するシアル酸受容体に結合することで引き起こされます。ウイルス粒子が複数の赤血球に同時に結合すると、赤血球同士が相互に連結されて網目状の構造、いわゆる格子構造を形成します。この格子構造が形成されると、赤血球は溶液中に均一に分散した状態（懸濁状態）を維持し、試験管やウェル全体が赤みを帯びて見えます。一方、ウイルス濃度が低い場合など、十分な格子構造が形成されないと、赤血球はその重みで容器の底に沈んで、中央に暗赤色の塊（ペレットまたはボタンと称される）を形成します。この凝集反応は、一部のブドウ球菌やビブリオ菌などの細菌によっても引き起こされることが知られています。HAおよびHIアッセイに用いられる赤血球は、測定対象となるウイルスや細菌の種類と、それらが結合する赤血球上の受容体との親和性に応じて、ニワトリ、七面鳥、ウマ、モルモット、ヒトなど様々な動物種から選択されます。

手順

HAアッセイの典型的な手順は、マイクロタイタープレート、特にU字底またはV字底の96ウェルプレートを用いて行われます。まず、測定したいウイルスを含むサンプルを、プレートの列方向に沿って段階的に希釈液を作成します。通常、最初のウェルには比較的高い濃度のサンプルが準備され、続くウェルでは例えば2倍ずつ段階的に希釈が進められます。プレートの最後のウェルは、ウイルスを含まない陰性対照として設定されます。各列には通常、異なるサンプルを用いて同様の希釈系列が準備されます。希釈液が準備されたら、全てのウェルに一定濃度の赤血球懸濁液を加え、穏やかに混ぜ合わせた後、室温で一定時間（例えば30分間）インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルを観察し、赤血球が凝集しているか、あるいは底に沈降してペレットを形成しているかを判別します。ウイルスの高濃度側では赤みがかった凝集像が見られ、低濃度側では中央にペレットが見られます。この凝集像からペレット像への移行は比較的明瞭に観察されます。

ウイルスサンプルの相対的な濃度、すなわち力価は、ペレットが観察される直前の、最後に凝集が確認されたウェルに基づいて決定されます。例えば、最後に凝集が確認されたウェルが元のサンプルを40倍に希釈したものであった場合、そのサンプルの力価は希釈率の逆数である40となります。ただし、最高濃度でも凝集が見られない場合は、力価が低いと判断され、最低の希釈率（例えば5）が力価として与えられることがあります。逆に、非常に高い濃度で、最低希釈率でもペレットが見られない場合は、最高希釈率（例えば5120）が力価として与えられ、非常に高い力価を持つサンプルであると判断されます。

HIアッセイは、HAアッセイに抗体を導入した変法であり、主にウイルスに対する抗体の濃度を測定することを目的とします。このアッセイでは、ウイルスと赤血球の結合（凝集）を抗体がどれだけ効果的に阻害するかを評価します。HIアッセイも同様にマイクロタイタープレートで行われ、まず測定したい抗体を含む血清やサンプルを段階的に希釈します。次に、標準化された量のウイルスを各ウェルに添加し、室温で約30分間インキュベートします。この過程で、サンプル中の抗体がウイルス粒子に結合し、ウイルスの凝集活性を中和します。その後、HAアッセイと同様に標準化された量の赤血球を各ウェルに加え、さらに室温でインキュベートします。最終的な結果の観察では、抗体濃度が高いウェルではウイルスの中和が起こり、赤血球の凝集が阻止されてペレットが形成されます。一方、抗体濃度が低いウェルではウイルスが中和されず、赤血球が凝集して懸濁状態が見られます。HI力価は、血球凝集を完全に阻止した血清の最終希釈率の逆数として定義されます。

なお、ここに述べられたHAおよびHIの実施方法はあくまで一般的な例であり、開始希釈率、希釈倍率、インキュベーション時間、使用するプレートの形状などは、各検査室の確立されたプロトコルや目的に応じて異なる場合があります。

利点

HAおよびHIアッセイの大きな利点は、その簡便さ、低コスト性、そして迅速性です。特殊な機器を必要とせず、比較的安価に入手可能な器具や試薬で実施でき、数時間以内に結果が得られます。また、これらの手法は世界中の多くの研究室や検査機関で長年用いられており、広く普及していることから、結果の比較やある程度の標準化が可能です。

制限事項

最適な結果を得るためには、インキュベーション時間、赤血球の濃度、赤血球の種類など、複数の実験条件を厳密に管理する必要があります。また、サンプル中に含まれるウイルスや抗体以外の非特異的な因子が、測定結果に影響を与え、不正確な力価の原因となる可能性があります。例えば、ウイルスと赤血球の結合を阻害する非特異的な物質や、抗体とウイルスとの結合を妨害する因子などが存在する場合があります。非特異的な阻害反応を防ぐため、測定前にサンプルを特定の酵素（受容体破壊酵素、RDEなど）で処理することが一般的です。HAおよびHIの結果の判定、特に力価の決定は、熟練した観察者による目視で行われることが多いため、主観が入りやすく、読影者間での判断にばらつきが生じる可能性があります。これにより、アッセイの再現性や客観性が損なわれることがあります。手作業による判定は記録化も手間がかかるため、通常は複数回の繰り返し読影が行われます。これらの潜在的な変動要因や読影者間の差異により、異なる検査室で得られた結果を比較することが難しい場合もあります。

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