ColE1

ColE1プラスミド：細菌の遺伝子ツールと複製機構

ColE1は、大腸菌をはじめとするグラム陰性菌でよく見られるプラスミドの一つです。プラスミドとは、細菌の主染色体DNAとは別に存在する、環状の二本鎖DNA分子であり、細胞内で独立して複製され、多様な遺伝情報（例えば抗生物質耐性遺伝子や毒素遺伝子など）を宿主に付与することがあります。ColE1という名前は、このプラスミドがタンパク質性の抗菌物質であるコリシンE1（Colicin E1）をコードする遺伝子（cea遺伝子）を持っていることに由来しています。

ColE1プラスミドは、コリシンE1遺伝子に加えて、自身が産生するコリシンE1に対する免疫を獲得するためのimm遺伝子も持っています。さらに、細胞間でプラスミドが伝達されるのに必要な一連の移動性（mob）遺伝子もコードしています。ColE1は比較的サイズが小さく、特定の制限酵素（例えばEcoRI）による認識部位が少なく存在するため、初期の遺伝子工学において外来DNAを導入・増幅させるためのベクター（運び屋）として広く利用されました。

独自の複製メカニズム

ColE1プラスミドの複製は、特定の開始点（ori）から始まります。この起点から約555塩基対上流には、複製を開始するための重要なRNA分子であるRNAIIを転写するプロモーターがあります。RNAポリメラーゼはこのプロモーターからRNAIIの合成を開始します。合成されたRNAIIは、新規DNA鎖の合成を開始するための「プレプライマー」として機能します。RNAIIは、複製起点付近で鋳型となるDNA鎖に相補的に結合し、ハイブリッド構造を形成します。このDNA-RNAハイブリッド構造は、RNAIIが特定の二次構造に折りたたまれることによって安定化されます。次に、宿主細胞に存在するRNase Hという酵素が作用します。RNase HはDNA-RNAハイブリッド中のRNA鎖を切断する活性を持つ酵素で、RNAIIの特定の箇所を切断し、DNAポリメラーゼがDNA合成を開始するための3'ヒドロキシル基を露出させます。これにより、DNAポリメラーゼIが鋳型DNA鎖に沿ってリーディングストランド（主鎖）の合成を開始します。一方、ラギングストランド（逆鎖）の合成は、後から宿主細胞由来のプライマーゼという酵素が合成するRNAプライマーによって開始されます。

興味深いことに、ColE1の複製は宿主細胞のタンパク質合成（翻訳）が阻害されても停止しません。これは、複製に必要なRNAIIの転写がタンパク質合成に直接依存しないためです。むしろ、翻訳が阻害されると、プラスミドのコピー数制御に関わるRop（Repressor of primer）タンパク質の合成も同時に阻害されるため、結果として細胞あたりのプラスミドコピー数が通常より増加することが知られています。

精緻なコピー数制御

ColE1プラスミドが細胞内で過剰に増殖するのを防ぎ、適切なコピー数を維持するためには、巧妙な制御機構が働いています。この制御の中心的な役割を担うのが、RNAIと呼ばれる短いRNA分子です。RNAIは、RNAIIの転写方向とは逆向きに、同じ領域から転写される「アンチセンスRNA」であり、RNAIIに相補的な配列を持っています。細胞内のColE1コピー数が増加すると、それに伴ってRNAIの濃度も上昇します。

RNAIは複製開始に必要なRNAIIの5'末端付近に結合します。この結合はRNAIIの立体構造を変化させ、RNAIIが鋳型DNAと安定したハイブリッド構造を形成することを妨げます。その結果、RNase HによるRNAIIの切断が効果的に起こらなくなり、DNAポリメラーゼによる新しいDNA鎖の合成開始が抑制されます。このように、プラスミドのコピー数が増加するとRNAIの濃度も上昇し、複製に必要なRNAIIの機能が阻害されることで、全体の複製速度が抑制されるという負のフィードバックループが形成されています。

さらに、ColE1プラスミドはRopタンパク質をコードしており、RopはRNAIとRNAIIの相互作用をさらに安定化させる補助因子として機能し、コピー数制御を補強します。特に宿主細胞の増殖速度が遅い条件下では、Ropタンパク質がプラスミドの過剰な複製（暴走複製）を防ぐ上で重要な役割を果たすことが示されています。

通常、ColE1プラスミドは細胞あたり10個から15個程度のコピー数で存在しますが、特定の条件下（例えば翻訳阻害下やRop変異株など）ではこの制御が破綻し、さらに増加することもあります。このような独自の複製およびコピー数制御機構は、ColE1プラスミドが細菌細胞内で安定して維持されるために不可欠な要素であり、遺伝子工学の分野においてもそのメカニズムの理解が基礎となっています。

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