DAPI
DAPI（ダピ、ダーピー、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）は、生体試料を蛍光標識するために用いられる色素の一種です。特にデオキシリボ核酸（DNA）に対して高い親和性を示し、強力に結合する性質を持っています。この特性から、主に蛍光顕微鏡観察において、細胞内のDNA構造を可視化するために広く利用されています。
この色素は1977年に初めて合成されました。当初は、寄生虫であるトリパノソーマの感染症に対する治療薬としての可能性を探る目的で開発されました。その後、蛍光顕微鏡と組み合わせることで、血液中のマラリア原虫のような病原体の検出に活用されました。現代では、細胞生物学の研究や検査において不可欠な試薬の一つとして、その重要性が確立されています。
DAPIの大きな利点の一つは、細胞膜を透過する性質を持っていることです。浸透速度は比較的遅いものの、生きた細胞とホルマリンなどで固定された細胞のどちらに対しても使用できます。生きた状態の細胞を染色できるため、観察試料の準備が比較的容易であり、この点がDAPIが広く普及している理由の一つとなっています。
色素としてのDAPIの特性を見てみましょう。DAPIは二重螺旋構造を持つDNAの「小さい溝」（マイナーグルーブ）に優先的に結合する性質があります。特にアデニン（A）とチミン（T）の塩基対が多く存在する領域に強く結合する傾向があります。蛍光顕微鏡で観察する際には、紫外光（UV）を励起光として照射します。二本鎖DNAに結合した状態のDAPIは、約358ナノメートル（nm）の波長の光を最も効率よく吸収し（吸収極大）、その結果として約461nmを極大とする青色から水色のような蛍光を発します。DAPIの蛍光スペクトルは比較的広範囲にわたります。
DAPIはDNAだけでなく、リボ核酸（RNA）にも結合することが知られていますが、RNAに結合した場合の蛍光波長は約500nm付近となり、その強度はDNA結合時と比較して著しく弱くなります。したがって、適切なフィルター（ダイクロイックミラー）を使用することで、RNA結合に由来する蛍光を観察から除外することが可能です。さらに、高濃度で使用すると、細胞内のポリリン酸も染色することがあり、この場合は約526nmで黄色い蛍光が観察されます。また、細胞骨格を構成する微小管にも結合して蛍光強度が増大することから、試験管内でのタンパク質（チューブリン）の重合過程を蛍光シグナルとして捉える、高感度な分析方法にも応用されています。
DAPIが放出する青い蛍光は、複数の蛍光色素を用いて試料を同時に染色する「多重染色」において非常に有効です。DAPIの青色蛍光は、緑色蛍光タンパク質（GFP）が放つ緑色蛍光や、テキサスレッドなどの赤色蛍光とは波長域が比較的離れています。これにより、完全に分離できるわけではありませんが、スペクトル解析や画像処理によって、それぞれの蛍光シグナルを容易に区別し、細胞内の異なる構造やタンパク質の局在を同時に観察することができます。細胞核の染色以外にも、培養細胞に混入したマイコプラズマやウイルスのDNAを特異的に染色し、それらを検出する目的にもよく利用されます。
ただし、DAPIの励起に必要な紫外光の照射は、細胞内にラジカルを生成し、他の蛍光色素の退色（光による蛍光の消失）を促進する可能性があります。これを抑制するためには、退色防止剤を併用することが推奨されており、これにより顕微鏡下での観察時間を延長できます。しかし、退色防止剤の中には生細胞に悪影響を及ぼすものがある点や、そもそも紫外光自体が細胞に損傷を与える可能性がある点には注意が必要です。
DNAを青色蛍光で可視化する色素としては、DAPIの他にもヘキスト染色剤（Hoechst stain）がよく用いられます。ヘキスト染色剤もDAPIと同様に、生細胞・固定細胞のどちらにも適用可能であり、DNAのATリッチ領域に優先的に結合する性質を持っています。
毒性に関しては、DAPIが生細胞を核染色する際に必要とされる濃度は、固定された細胞を染色する場合よりもかなり高くなります。一部のメーカーの安全データシート（MSDS）には非毒性と記載されている場合があり、大腸菌を用いた実験では変異原性は確認されなかったという報告もあります。一方で、変異原性があるとの記載も見られますが、その根拠は必ずしも明確ではありません。DAPIは遺伝情報の本体であるDNAに結合するため、たとえ低濃度であっても変異原として作用する潜在的なリスクは考慮すべきです。DAPIを取り扱う際には、使い捨て手袋を使用するなど、慎重な作業が推奨されます。
保管については、科学的、身体的、毒物学的に不明な点が多いとされています。皮膚、目、呼吸器系への接触を避け、密閉できる容器に入れて冷蔵保存することが望ましいです。
この色素は1977年に初めて合成されました。当初は、寄生虫であるトリパノソーマの感染症に対する治療薬としての可能性を探る目的で開発されました。その後、蛍光顕微鏡と組み合わせることで、血液中のマラリア原虫のような病原体の検出に活用されました。現代では、細胞生物学の研究や検査において不可欠な試薬の一つとして、その重要性が確立されています。
DAPIの大きな利点の一つは、細胞膜を透過する性質を持っていることです。浸透速度は比較的遅いものの、生きた細胞とホルマリンなどで固定された細胞のどちらに対しても使用できます。生きた状態の細胞を染色できるため、観察試料の準備が比較的容易であり、この点がDAPIが広く普及している理由の一つとなっています。
色素としてのDAPIの特性を見てみましょう。DAPIは二重螺旋構造を持つDNAの「小さい溝」（マイナーグルーブ）に優先的に結合する性質があります。特にアデニン（A）とチミン（T）の塩基対が多く存在する領域に強く結合する傾向があります。蛍光顕微鏡で観察する際には、紫外光（UV）を励起光として照射します。二本鎖DNAに結合した状態のDAPIは、約358ナノメートル（nm）の波長の光を最も効率よく吸収し（吸収極大）、その結果として約461nmを極大とする青色から水色のような蛍光を発します。DAPIの蛍光スペクトルは比較的広範囲にわたります。
DAPIはDNAだけでなく、リボ核酸（RNA）にも結合することが知られていますが、RNAに結合した場合の蛍光波長は約500nm付近となり、その強度はDNA結合時と比較して著しく弱くなります。したがって、適切なフィルター（ダイクロイックミラー）を使用することで、RNA結合に由来する蛍光を観察から除外することが可能です。さらに、高濃度で使用すると、細胞内のポリリン酸も染色することがあり、この場合は約526nmで黄色い蛍光が観察されます。また、細胞骨格を構成する微小管にも結合して蛍光強度が増大することから、試験管内でのタンパク質（チューブリン）の重合過程を蛍光シグナルとして捉える、高感度な分析方法にも応用されています。
DAPIが放出する青い蛍光は、複数の蛍光色素を用いて試料を同時に染色する「多重染色」において非常に有効です。DAPIの青色蛍光は、緑色蛍光タンパク質（GFP）が放つ緑色蛍光や、テキサスレッドなどの赤色蛍光とは波長域が比較的離れています。これにより、完全に分離できるわけではありませんが、スペクトル解析や画像処理によって、それぞれの蛍光シグナルを容易に区別し、細胞内の異なる構造やタンパク質の局在を同時に観察することができます。細胞核の染色以外にも、培養細胞に混入したマイコプラズマやウイルスのDNAを特異的に染色し、それらを検出する目的にもよく利用されます。
ただし、DAPIの励起に必要な紫外光の照射は、細胞内にラジカルを生成し、他の蛍光色素の退色（光による蛍光の消失）を促進する可能性があります。これを抑制するためには、退色防止剤を併用することが推奨されており、これにより顕微鏡下での観察時間を延長できます。しかし、退色防止剤の中には生細胞に悪影響を及ぼすものがある点や、そもそも紫外光自体が細胞に損傷を与える可能性がある点には注意が必要です。
DNAを青色蛍光で可視化する色素としては、DAPIの他にもヘキスト染色剤（Hoechst stain）がよく用いられます。ヘキスト染色剤もDAPIと同様に、生細胞・固定細胞のどちらにも適用可能であり、DNAのATリッチ領域に優先的に結合する性質を持っています。
毒性に関しては、DAPIが生細胞を核染色する際に必要とされる濃度は、固定された細胞を染色する場合よりもかなり高くなります。一部のメーカーの安全データシート（MSDS）には非毒性と記載されている場合があり、大腸菌を用いた実験では変異原性は確認されなかったという報告もあります。一方で、変異原性があるとの記載も見られますが、その根拠は必ずしも明確ではありません。DAPIは遺伝情報の本体であるDNAに結合するため、たとえ低濃度であっても変異原として作用する潜在的なリスクは考慮すべきです。DAPIを取り扱う際には、使い捨て手袋を使用するなど、慎重な作業が推奨されます。
保管については、科学的、身体的、毒物学的に不明な点が多いとされています。皮膚、目、呼吸器系への接触を避け、密閉できる容器に入れて冷蔵保存することが望ましいです。
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