ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティング（Western blotting; WB）は、生命科学分野において特定のタンパク質を検出・定量するために広く用いられる基本的な手法です。別名イムノブロット（immunoblot; IB）とも呼ばれ、研究者の間ではしばしば単に「ウェスタン」と略されます。

命名の由来

この手法の名称は、核酸検出法であるサザンブロッティング（Southern blotting）とノーザンブロッティング（Northern blotting）に倣って名付けられました。これらの先行する手法が核酸分子の相補性を利用するのに対し、ウェスタンブロッティングはタンパク質に対する抗体の高い特異性を利用して目的分子を識別します。これは半ばユーモラスな命名の流れと言えます。

原理と手順

ウェスタンブロッティングの基本的な流れは以下の通りです。

1. サンプル調製: 細胞や組織からタンパク質を抽出します。通常、タンパク質の立体構造を破壊し、均一な負電荷を与えるために、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような界面活性剤や還元剤を含むバッファーに溶解させます。
2. 電気泳動: 調製したサンプルをポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動（特にSDS-PAGE）にかけます。これにより、タンパク質は主に分子量に基づいてゲル内で分離されます。
3. 転写（ブロッティング）: 電気泳動後にゲル内のタンパク質を、ニトロセルロース膜やPVDF膜などの固相支持体（メンブレン）に転写します。このステップにより、ゲル上で分離されたタンパク質のパターンが膜上に固定されます。
4. ブロッキング: 膜上のタンパク質が存在しない領域に、非特異的な抗体の結合を防ぐためのブロッキング剤（脱脂粉乳やBSAなど）を結合させます。
5. 抗体反応: 検出したい特定のタンパク質に対する一次抗体を膜に反応させます。この抗体が目的タンパク質に特異的に結合します。
6. 二次抗体反応と検出: 一次抗体に結合する二次抗体を反応させます。二次抗体には通常、酵素（HRPやALPなど）や蛍光色素などの標識が結合しており、この標識を利用して目的タンパク質の存在を可視化・検出します。

得られる情報と応用

ウェスタンブロッティングによって、サンプル中に特定のタンパク質が存在するかどうか、その量はどれくらいかを知ることができます。さらに、リン酸化や糖鎖付加といったタンパク質の化学修飾状態を特異的に認識する抗体を用いれば、その修飾状態を調べることが可能です。

また、免疫沈降法（immunoprecipitation; IP）などの別の手法と組み合わせることで、目的のタンパク質が他のどのようなタンパク質と結合しているかといったタンパク質間の相互作用を解析することもできます。

この手法は基礎研究だけでなく、臨床診断や食品安全検査など幅広い分野で応用されています。例えば、狂牛病の検査において、異常型プリオンタンパク質を検出するための重要な確認手法の一つとして利用されています。

使用される装置

ゲルから膜へのタンパク質転写に用いられる装置にはいくつかの種類があります。

セミドライ式: 短時間で転写が可能で、必要なバッファー量も少ないという利点がありますが、高分子量タンパク質の転写効率が比較的低い傾向があります。
タンク式: 多量のバッファーを使用しますが、冷却しながら転写できるため、高分子量タンパク質の転写にも適しています。アガロースゲルからの転写にも対応できる場合があります。
* セミウェット式: これら以外にも様々な方式があり、実験目的やサンプルの性質に応じて最適な装置を選択することが重要です。

ウェスタンブロッティングは、その高い特異性と感度から、現代の生命科学研究において欠かすことのできない極めて重要な技術であり、多くの研究室で日常的に行われています。

もう一度検索