ジエチルピロカーボネート

ジエチルピロカーボネート（DEPC）について

ジエチルピロカーボネート（Diethylpyrocarbonate、略称 DEPC）は、分子生物学の実験における重要な試薬の一つで、特にRNA関連の実験で使用されます。DEPCは、RNAを分解する酵素であるRNaseを失活させるために利用され、これによって研究室でRNAを扱う際の分解リスクを軽減する役割を果たします。

DEPCの作用機序

DEPCがRNaseを失活させるメカニズムは、DEPCがRNaseのヒスチジン残基に対して共有結合的な修飾を行うことによります。このため、DEPCを使用する際には、他のバッファに対しても留意が必要で、特にヒスチジン残基を持つTrisやHEPESバッファではDEPCは利用されません。一方で、PBSやMOPSにはDEPCを使用することができます。

簡単に言えば、反応性の高い-O、-N、-Sといった基を持つ酵素や化学物質には、DEPCによるRNaseフリー処理が行えないということです。これを念頭に置くことが、実験の成功に繋がります。

DEPC処理のプロセス

RNaseを失活させるためには、まず水に対して0.1%のDEPCを添加します。この混合物を37℃の条件下で1時間以上反応させた後、121℃のオートクレーブで15分以上処理します。この工程で未反応のDEPCは不活性化されます。この方法により、DEPCが分解されて生成される副産物には、水、二酸化炭素、エタノールが含まれます。

DEPCの濃度が高いほど、より多くのRNaseを失活させることが可能ですが、DEPCやその分解時の副生成物が残存すると、in vitro翻訳などの次の実験ステップに悪影響を及ぼすことがあります。さらに、RNAそのものもカルボキシメチル化といった修飾を受ける可能性があり、このことはバッファ交換を実施しても元に戻ることはありません。

ヒスチジン残基の重要性

DEPCによるヒスチジンの修飾は、酵素におけるヒスチジン残基の役割を確認するためにも利用されます。DEPCがヒスチジンを修飾する際、これはイミダゾール環の窒素に対するエトキシカルボニル化を伴います。この修飾は可逆的であり、中性条件下で0.5Mのヒドロキシルアミンで処理することで元の状態に戻すことが可能です。この性質は、実験を通じて酵素の機能や構造を探求する際に非常に有用です。

まとめ

ジエチルピロカーボネートは、RNA研究における重要なツールです。RNaseを効果的に失活させるこの試薬は、RNA分解のリスクを回避し、他の実験操作においても注意深く扱う必要があります。それによって、RNAの研究や分子生物学的な実験を進める上での信頼性が向上します。

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