リアルタイムPCR

リアルタイムPCRについて

リアルタイムPCR（Real-time PCR）は、DNAの定量分析を行うための技術であり、定量PCR（Q-PCR）の一形態です。この方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を通じてDNAを増幅し、その進行状況をリアルタイムで測定します。増幅の過程で生成されたDNAの量を推定するために、蛍光色素が用いられます。

定量方法

リアルタイムPCRの定量は一般に、蛍光シグナルを測定することで行われ、この過程には主に二つの方法があります。第一はインターカレーション法で、SYBR Green Iなどの色素が二本鎖DNAに結合して蛍光を発します。もう一つはハイブリダイゼーション法で、特異的なDNA配列に結合するTaqManプローブが代表的な例です。

SYBR Green法

SYBR Green法の主な利点は、プローブを必要としないために経済的であり、また準備も簡単である点です。しかし、プライマー二量体などの非特異的なDNAも検出されるため、特異性が低いことが欠点です。この問題を補完するために、融解曲線分析が利用されます。

融解曲線分析

融解曲線分析ではPCR反応後に温度を徐々に上げ、SYBR Green Iのシグナルを観察します。このシグナルは、二本鎖が形成されている状態で高く、温度が上がるにつれて接合が解けていくため、シグナルが減少します。このピークの数が非特異的な増幅の指標となります。

TaqManプローブ法

TaqManプローブ法では、特異的な配列に基づいた蛍光プローブを使用します。プローブの5'末端には蛍光物質、3'末端にはクエンチャーが結合されていて、PCR反応が進むにつれプローブが分解されます。これにより、蛍光シグナルが発生し、増幅したDNAの量を確認できます。この方法は特異性が高い反面、プローブの設計と合成にはコストがかかります。

定量RT-PCR

リアルタイムPCRは逆転写PCRとも組み合わさることがあり、これにより少量のmRNAを定量することも可能です。これを定量RT-PCR（quantitative reverse transcription PCR）と呼び、One-stepとTwo-stepの二つの方法があります。One-step法は効率と感度が高く、少ない手順で進行します。

定量的評価方法

リアルタイムPCRの定量方法には、目的のDNAコピーを直接数える絶対定量法と、相対的に発現を評価する相対定量法がある。絶対定量法は検量線を用いて厳密な比較を行い、主にウイルスや細菌の検出に使用されます。一方、相対定量法は目的遺伝子とリファレンス遺伝子との比較により、発現レベルを評価します。

医療への応用

リアルタイムPCRは、B型肝炎ウイルスやC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの定量において広く利用されており、感度と迅速性において大きな進歩を見せています。また、結核菌や新型コロナウイルスの検査も行われています。これにより、精巧な評価が可能になり、医療現場での実用性が高まっています。

まとめ

リアルタイムPCRは、非常に感度の高い定量技術であり、今後もさまざまな研究や臨床診断において利用が進むことが期待されます。技術の進化とともに、その研究分野も日々進展しており、さらなる活用が期待されています。

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