免疫沈降法

免疫沈降法（Immunoprecipitation, IP）

免疫沈降法（Immunoprecipitation, 略称: IP）は、生化学や分子生物学の分野で広く用いられる実験手法です。この方法は、特定の生体分子（主にタンパク質などの抗原）を、それに対して特異的に結合する抗体を利用して、複雑な試料溶液の中から選択的に分離、濃縮、あるいは精製することを目的としています。

原理

免疫沈降法の基本原理は、抗原と抗体が特異的に結合すると、その複合体が溶液中で不溶化し、沈殿物を形成するという免疫沈降反応にあります。この反応を利用して、目的の抗原を溶液から物理的に分離します。実験においては、抗体をそのまま溶液に加えるだけでなく、多くの場合、ビーズ状の固体支持体（担体）に固定化して使用します。これにより、形成された抗原抗体複合体の回収が容易になります。

古典的な担体としては、セファロースやアガロースといった多孔性のゲルビーズが用いられてきました。これに対し、近年ではプロテインAやプロテインGなど、抗体と強い親和性を持つタンパク質を表面に固定化した超常磁性の磁気ビーズが広く普及しています。磁気ビーズを用いる方法は、遠心分離による沈殿回収ではなく、磁石を用いてビーズをチューブ壁に集めることで分離を行うため、操作が簡便であり、多孔性ビーズに比べて非特異的な物質の吸着（バックグラウンド）を低く抑えられる利点があります。また、短時間で効率的な分離が可能です。

用いる抗体は、目的の抗原に対する特異性が高く、結合力（力価）が十分にあることが重要です。一般的に、多様なエピトープを認識するポリクローナル抗体の方が、単一のエピトープを認識するモノクローナル抗体よりも免疫沈降に適しているケースが多いとされます。

標準的な手法

免疫沈降法の手順は、使用する担体によって若干異なりますが、一般的な流れは以下の通りです。

1. 前処理（オプション）: サンプル（細胞ライセートなど）中の非特異的な結合成分を低減するため、目的の抗原に対する特異性を持たないコントロール抗体やブランクの担体とサンプルを混合し、非特異的に吸着した物質を遠心分離などで除去する工程を行うことがあります。
2. 免疫複合体形成: 前処理後のサンプル溶液に、目的の抗原に対する特異的な抗体を適切な濃度で添加し、抗原抗体複合体が形成されるまでインキュベートします。抗体を担体に固定化している場合は、担体ごと添加します。
3. 複合体の回収: 形成された抗原抗体複合体を含む担体を溶液から分離します。セファロースビーズなどの場合は遠心分離によって沈殿を回収します。磁気ビーズの場合は、チューブを磁石に近づけてビーズを壁面に集め、上清を除去します。
4. 洗浄: 回収した沈殿物（担体と結合した複合体）を、目的の複合体以外の夾雑物を取り除くために、洗浄バッファーで数回丁寧に洗浄します。この際、洗浄が不十分だとバックグラウンドが高くなり、洗浄が強すぎると目的の複合体が解離してしまうため、バッファーの組成や洗浄回数を適切に調整する必要があります。
5. 溶出と解析: 洗浄後、担体から目的の抗原とその結合因子を溶出バッファーを用いて分離・回収します。溶出液は、SDS-PAGE、ウェスタンブロット、質量分析などの下流の解析に供され、目的の抗原の存在を確認したり、共沈殿してきた他の分子を同定したりします。

磁気ビーズ法は、遠心分離に比べて分離操作が穏やかであり、サンプルの物理的なストレスが少ないため、特にデリケートな複合体の解析に適しています。

応用：タンパク質間相互作用の検出

免疫沈降法は、細胞内で特定のタンパク質がどのような他のタンパク質と物理的に結合しているか（タンパク質間相互作用）を調べるために広く応用されています。この手法を共免疫沈降法（Co-immunoprecipitation, Co-IP）と呼びます。

Co-IPでは、解析したい目的タンパク質（これを「ベイト」タンパク質と呼びます）に対する抗体を用いて免疫沈降を行います。もしベイトタンパク質が細胞内で他のタンパク質（「プレイ」タンパク質）と複合体を形成していれば、ベイトタンパク質が抗体によって回収される際に、それに結合しているプレイタンパク質も一緒に沈殿してくるはずです。この共沈殿してきたプレイタンパク質を下流の解析で検出することで、ベイトタンパク質とプレイタンパク質が相互作用していることを示唆できます。

Co-IPと類似した手法にプルダウン法（Pull-down assay）があります。プルダウン法もタンパク質間相互作用を調べるために用いられますが、抗原に対する抗体を用いる代わりに、解析したいタンパク質にあらかじめ遺伝子操作によって特定の短いアミノ酸配列（タグ、例：Hisタグ, GSTタグ, FLAGタグなど）を付加しておき、そのタグに特異的に結合するリガンド（例えばHisタグにはニッケルイオンをキレートしたビーズ、GSTタグにはグルタチオン固定化ビーズ）を固定化した担体を用いて、タグ付きタンパク質とその複合体を回収します。この方法では、目的タンパク質に対する抗体が入手困難な場合や、タグを利用することでより効率的な回収を目指す場合に有効です。

これらの応用手法により、細胞内での複雑な分子ネットワークの解明が進んでいます。

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