Hisタグ
Hisタグ（ヒスタグ、His-tag）は、遺伝子工学的手法を用いて作製した組換えタンパク質の精製に利用される、短いペプチド配列からなる分子タグの一種です。通常、6個のヒスチジン残基が連続して配置された配列（6xHisタグ）が、目的タンパク質のN末端またはC末端に付加されます。His・Tagはドイツのメルク社の登録商標です。
Hisタグを用いた精製は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC）の原理に基づいています。タンパク質は一般的に、分子表面で金属イオンと結合する性質を持っています。この親和性の違いを利用してタンパク質を分離する手法がIMACであり、1975年にその概念が発表されました。その後の研究により、タンパク質を構成するアミノ酸の中でも、特にヒスチジン残基が金属イオンとの強い配位結合に関与することが明らかになりました。この性質を利用し、目的タンパク質に Hisタグを付加することで、金属イオンに対するそのタンパク質の親和性を人工的に著しく高めることが可能になります。
Hisタグを持つタンパク質は、一般的に pH 8 以上の条件下で、ニッケルやコバルトといった金属イオンが固定化された不溶性の担体と接触すると、Hisタグのヒスチジン残基が金属イオンをキレート（配位結合）することで担体に強く結合します。一方、 Hisタグを持たない他のタンパク質は、担体にほとんど結合しないか、ごく弱い結合を示すにとどまります。この性質を利用して、適切なバッファーで担体を洗浄することで、 Hisタグを持たない不純物タンパク質を除去できます。その後、結合している Hisタグ付きタンパク質は、担体から特異的に溶出させることで回収されます。
Hisタグを用いた精製には、使用する担体や金属イオン、溶出条件など、いくつかの要素を適切に選択する必要があります。
担体: 一般的に用いられる担体としては、Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) など、様々な種類のものが市販されています。これらはカラムに充填して使用する方式のほか、試験管内で遠心分離や磁気分離と組み合わせて使用できる形式のものもあります。
金属イオン: 担体に固定化する金属イオンの種類によって、Hisタグとの親和性が異なります。一般的には銅が最も親和性が高く、次いでニッケル、亜鉛、コバルトの順に親和性が低下します。ルーチン的な精製にはニッケルがよく用いられますが、より高い純度を目指す場合には、コバルト担体が選択されることがあります。
溶出法: 担体に結合した Hisタグ付きタンパク質を回収する方法はいくつかあります。タンパク質の活性を維持するためには、できるだけ穏やかな条件での溶出が望まれます。
類似体との競合: ヒスチジン側鎖の構造に類似した化合物を高濃度で添加し、 Hisタグと金属イオン間の配位結合を競合的に阻害する方法です。最も一般的に用いられるのはイミダゾールで、通常150 mM以上の濃度で使用されます。ヒスチジンやヒスタミンも使用されることがあります。
pHの低下: バッファーの pH を低下させると、ヒスチジン残基がプロトン化し、金属イオンとの配位結合が弱まります。これにより、タンパク質が担体から解離します。ニッケル担体では pH 4 程度、コバルト担体では pH 6 程度で溶出されることが多いです。
金属イオンの除去: 担体に固定化されている金属イオンを強力なキレート剤（例: EDTA）で除去することで、タンパク質を強制的に担体から解離させる方法です。
Hisタグの主要かつ最も一般的な用途は、大腸菌などの原核生物や酵母などの真核生物を用いて生産された組換えタンパク質をアフィニティ精製することです。
組換えタンパク質を発現させた細胞を破砕して得られる粗抽出液には、目的のHisタグ付きタンパク質以外にも様々な細胞由来のタンパク質が含まれています。Hisタグの高い金属イオン親和性を利用することで、粗抽出液から Hisタグ付きタンパク質を選択的に担体に結合させ、他の夾雑タンパク質を洗い流すことができます。
ただし、Hisタグを持たないタンパク質の中にも、担体と弱く結合するものや、場合によっては Hisタグ付きタンパク質と同程度に強く結合してしまうもの（例: 大腸菌由来の SlyD タンパク質）が存在し、不純物となることがあります。このような夾雑物を減らすためには、洗浄バッファーに比較的低濃度のイミダゾール（例: 20 mM 程度）を添加して弱い結合を洗い流す、特定の夾雑タンパク質をコードする遺伝子を欠損させた宿主細胞を使用する、あるいは Hisタグ以外の別のアフィニティタグを用いたタンデム精製を行うなどの対策が講じられます。金属イオンとしてコバルト担体を用いると、ニッケル担体よりも SlyD などの特定の不純物の結合を抑えられるため、シングルステップでの純度を改善できる場合があります。
Hisタグは比較的小さなタグであるため、精製後のタンパク質から除去せずにそのまま使用されることも多いですが、 Hisタグの電荷がタンパク質の機能や構造に影響を与える場合や、下流の実験でタグが邪魔になる場合は除去が必要です。 Hisタグと目的タンパク質の間に、特異的なエンドペプチダーゼの認識配列を導入しておき、精製後に酵素処理によって Hisタグを切断除去する方法がよく用いられます。また、HisタグがN末端にある場合は、ジペプチジルアミノペプチダーゼを用いてタグ配列を段階的に消化し、特定の配列で消化が停止するように設計されたシステムも利用されています。 Hisタグを除去した後、再度 IMAC を行うことで、タグが除去された目的タンパク質だけをさらに高純度で回収できます。
Hisタグを用いた精製は、タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）に依存するため、タンパク質が変性した状態でも適用できる利点があります。例えば、大腸菌での高発現によって形成される封入体から、尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤を用いて Hisタグ付きタンパク質を可溶化し、そのまま精製することが可能です。これに対し、多くの抗体を用いたアフィニティ精製やGSTタグを用いた精製では、タンパク質が正しくフォールディングしている必要があります。ただし、 Hisタグ付きタンパク質は他のタグ付きタンパク質に比べて凝集しやすい傾向があるとも言われています。
Hisタグは、タンパク質間の相互作用を調べるプルダウンアッセイにも応用できます。しかし、他のタグシステムに比べて感度が劣る場合があり、還元的条件や特定の界面活性剤、EDTAなどが使用できないといった実験上の制限が生じやすいです。
また、マイクロタイタープレートやガラススライドなどの表面を金属イオンでコーティングしておくことで、Hisタグ付きタンパク質を容易に固定化する用途にも使われます。
Hisタグを目的タンパク質に付加するには、遺伝子操作が必要です。最も一般的な方法は、 Hisタグ配列を含む発現ベクターに、目的タンパク質の遺伝子を組み込むことです。これにより、発現されたタンパク質のN末端またはC末端にHisタグが付加されます。どちらの末端に付加するかは、目的タンパク質の機能、構造、または精製後に Hisタグを除去するかどうかなどを考慮して決定されます。
Hisタグ配列は比較的短いため、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法もあります。目的遺伝子を増幅する際に、 Hisタグ配列（ヒスチジンをコードする CAT や CAC コドンが連続した配列）を含むように設計したプライマーを使用することで、PCR産物である遺伝子断片の末端に直接 Hisタグ配列を付加することが可能です。
Hisタグが目的タンパク質に正しく付加されているか、あるいは精製された Hisタグ付きタンパク質を検出するには、主に抗Hisタグ抗体を用いる方法や、金属イオンに結合する蛍光プローブを用いる方法があります。Hisタグ（6xHisタグ）が付加されることで、タンパク質の分子量は理論上約1 kDa増加します。ただし、SDS-PAGEなどで分子量を測定した場合、Hisタグの特性により、見かけの分子量が理論値よりも数 kDa 大きく観測される傾向があります。
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーに関する広範な特許は、1984年にイーライリリー社が出願し、1986年に成立しましたが、2005年までに期間満了しています。現在一般的に使用されている6xHisタグに関する特許は、ロシュ社が1987年に開発し、1994年に取得しましたが、こちらも2011年に期間満了しています。
Hisタグ以外にも、金属イオンへの親和性を利用する類似のペプチドタグが開発されています。
HQタグ: ヒスチジンとグルタミンが交互に並んだ配列（例: HQHQHQ）を持つタグです。
HNタグ: ヒスチジンとアスパラギンが交互に並んだ配列（例: HNHNHNHNHNHN）を持つタグです。 Hisタグよりもタンパク質表面に提示されやすく、金属イオンとの結合効率が優れているとされています。
HATタグ: ニワトリ乳酸脱水素酵素由来のペプチド配列（例: KDHLIHNVHKEEHAHAHNK）を持つタグです。Hisタグよりも電荷の偏りが少なく、可溶性が高い傾向があります。また、ヒスチジンの配置が立体的であるため、金属イオンとの結合効率が Hisタグより高いとされています。
参考文献
Ni-NTAアフィニティーカラム（蛋白質科学会アーカイブ#019）
（上記の参考文献は、記述内容の出典の一部ですが、本記事は参照元をそのまま転載したものではありません。）
原理
Hisタグを用いた精製は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC）の原理に基づいています。タンパク質は一般的に、分子表面で金属イオンと結合する性質を持っています。この親和性の違いを利用してタンパク質を分離する手法がIMACであり、1975年にその概念が発表されました。その後の研究により、タンパク質を構成するアミノ酸の中でも、特にヒスチジン残基が金属イオンとの強い配位結合に関与することが明らかになりました。この性質を利用し、目的タンパク質に Hisタグを付加することで、金属イオンに対するそのタンパク質の親和性を人工的に著しく高めることが可能になります。
Hisタグを持つタンパク質は、一般的に pH 8 以上の条件下で、ニッケルやコバルトといった金属イオンが固定化された不溶性の担体と接触すると、Hisタグのヒスチジン残基が金属イオンをキレート（配位結合）することで担体に強く結合します。一方、 Hisタグを持たない他のタンパク質は、担体にほとんど結合しないか、ごく弱い結合を示すにとどまります。この性質を利用して、適切なバッファーで担体を洗浄することで、 Hisタグを持たない不純物タンパク質を除去できます。その後、結合している Hisタグ付きタンパク質は、担体から特異的に溶出させることで回収されます。
実用上の選択肢
Hisタグを用いた精製には、使用する担体や金属イオン、溶出条件など、いくつかの要素を適切に選択する必要があります。
担体: 一般的に用いられる担体としては、Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) など、様々な種類のものが市販されています。これらはカラムに充填して使用する方式のほか、試験管内で遠心分離や磁気分離と組み合わせて使用できる形式のものもあります。
金属イオン: 担体に固定化する金属イオンの種類によって、Hisタグとの親和性が異なります。一般的には銅が最も親和性が高く、次いでニッケル、亜鉛、コバルトの順に親和性が低下します。ルーチン的な精製にはニッケルがよく用いられますが、より高い純度を目指す場合には、コバルト担体が選択されることがあります。
溶出法: 担体に結合した Hisタグ付きタンパク質を回収する方法はいくつかあります。タンパク質の活性を維持するためには、できるだけ穏やかな条件での溶出が望まれます。
類似体との競合: ヒスチジン側鎖の構造に類似した化合物を高濃度で添加し、 Hisタグと金属イオン間の配位結合を競合的に阻害する方法です。最も一般的に用いられるのはイミダゾールで、通常150 mM以上の濃度で使用されます。ヒスチジンやヒスタミンも使用されることがあります。
pHの低下: バッファーの pH を低下させると、ヒスチジン残基がプロトン化し、金属イオンとの配位結合が弱まります。これにより、タンパク質が担体から解離します。ニッケル担体では pH 4 程度、コバルト担体では pH 6 程度で溶出されることが多いです。
金属イオンの除去: 担体に固定化されている金属イオンを強力なキレート剤（例: EDTA）で除去することで、タンパク質を強制的に担体から解離させる方法です。
用途
タンパク質精製
Hisタグの主要かつ最も一般的な用途は、大腸菌などの原核生物や酵母などの真核生物を用いて生産された組換えタンパク質をアフィニティ精製することです。
組換えタンパク質を発現させた細胞を破砕して得られる粗抽出液には、目的のHisタグ付きタンパク質以外にも様々な細胞由来のタンパク質が含まれています。Hisタグの高い金属イオン親和性を利用することで、粗抽出液から Hisタグ付きタンパク質を選択的に担体に結合させ、他の夾雑タンパク質を洗い流すことができます。
ただし、Hisタグを持たないタンパク質の中にも、担体と弱く結合するものや、場合によっては Hisタグ付きタンパク質と同程度に強く結合してしまうもの（例: 大腸菌由来の SlyD タンパク質）が存在し、不純物となることがあります。このような夾雑物を減らすためには、洗浄バッファーに比較的低濃度のイミダゾール（例: 20 mM 程度）を添加して弱い結合を洗い流す、特定の夾雑タンパク質をコードする遺伝子を欠損させた宿主細胞を使用する、あるいは Hisタグ以外の別のアフィニティタグを用いたタンデム精製を行うなどの対策が講じられます。金属イオンとしてコバルト担体を用いると、ニッケル担体よりも SlyD などの特定の不純物の結合を抑えられるため、シングルステップでの純度を改善できる場合があります。
Hisタグは比較的小さなタグであるため、精製後のタンパク質から除去せずにそのまま使用されることも多いですが、 Hisタグの電荷がタンパク質の機能や構造に影響を与える場合や、下流の実験でタグが邪魔になる場合は除去が必要です。 Hisタグと目的タンパク質の間に、特異的なエンドペプチダーゼの認識配列を導入しておき、精製後に酵素処理によって Hisタグを切断除去する方法がよく用いられます。また、HisタグがN末端にある場合は、ジペプチジルアミノペプチダーゼを用いてタグ配列を段階的に消化し、特定の配列で消化が停止するように設計されたシステムも利用されています。 Hisタグを除去した後、再度 IMAC を行うことで、タグが除去された目的タンパク質だけをさらに高純度で回収できます。
Hisタグを用いた精製は、タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）に依存するため、タンパク質が変性した状態でも適用できる利点があります。例えば、大腸菌での高発現によって形成される封入体から、尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤を用いて Hisタグ付きタンパク質を可溶化し、そのまま精製することが可能です。これに対し、多くの抗体を用いたアフィニティ精製やGSTタグを用いた精製では、タンパク質が正しくフォールディングしている必要があります。ただし、 Hisタグ付きタンパク質は他のタグ付きタンパク質に比べて凝集しやすい傾向があるとも言われています。
その他の利用
Hisタグは、タンパク質間の相互作用を調べるプルダウンアッセイにも応用できます。しかし、他のタグシステムに比べて感度が劣る場合があり、還元的条件や特定の界面活性剤、EDTAなどが使用できないといった実験上の制限が生じやすいです。
また、マイクロタイタープレートやガラススライドなどの表面を金属イオンでコーティングしておくことで、Hisタグ付きタンパク質を容易に固定化する用途にも使われます。
タグの付加法
Hisタグを目的タンパク質に付加するには、遺伝子操作が必要です。最も一般的な方法は、 Hisタグ配列を含む発現ベクターに、目的タンパク質の遺伝子を組み込むことです。これにより、発現されたタンパク質のN末端またはC末端にHisタグが付加されます。どちらの末端に付加するかは、目的タンパク質の機能、構造、または精製後に Hisタグを除去するかどうかなどを考慮して決定されます。
Hisタグ配列は比較的短いため、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法もあります。目的遺伝子を増幅する際に、 Hisタグ配列（ヒスチジンをコードする CAT や CAC コドンが連続した配列）を含むように設計したプライマーを使用することで、PCR産物である遺伝子断片の末端に直接 Hisタグ配列を付加することが可能です。
検出
Hisタグが目的タンパク質に正しく付加されているか、あるいは精製された Hisタグ付きタンパク質を検出するには、主に抗Hisタグ抗体を用いる方法や、金属イオンに結合する蛍光プローブを用いる方法があります。Hisタグ（6xHisタグ）が付加されることで、タンパク質の分子量は理論上約1 kDa増加します。ただし、SDS-PAGEなどで分子量を測定した場合、Hisタグの特性により、見かけの分子量が理論値よりも数 kDa 大きく観測される傾向があります。
特許
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーに関する広範な特許は、1984年にイーライリリー社が出願し、1986年に成立しましたが、2005年までに期間満了しています。現在一般的に使用されている6xHisタグに関する特許は、ロシュ社が1987年に開発し、1994年に取得しましたが、こちらも2011年に期間満了しています。
類似したタグ
Hisタグ以外にも、金属イオンへの親和性を利用する類似のペプチドタグが開発されています。
HQタグ: ヒスチジンとグルタミンが交互に並んだ配列（例: HQHQHQ）を持つタグです。
HNタグ: ヒスチジンとアスパラギンが交互に並んだ配列（例: HNHNHNHNHNHN）を持つタグです。 Hisタグよりもタンパク質表面に提示されやすく、金属イオンとの結合効率が優れているとされています。
HATタグ: ニワトリ乳酸脱水素酵素由来のペプチド配列（例: KDHLIHNVHKEEHAHAHNK）を持つタグです。Hisタグよりも電荷の偏りが少なく、可溶性が高い傾向があります。また、ヒスチジンの配置が立体的であるため、金属イオンとの結合効率が Hisタグより高いとされています。
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参考文献
Ni-NTAアフィニティーカラム（蛋白質科学会アーカイブ#019）
（上記の参考文献は、記述内容の出典の一部ですが、本記事は参照元をそのまま転載したものではありません。）
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