蛍光 in situ ハイブリダイゼーション

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH)

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション、略称FISH（フィッシュ）は、生体試料中の特定の核酸配列（DNAやRNA）を、その場（in situ）で検出・可視化するための分子生物学的な手法の一つです。この技術は、蛍光物質で標識された短い核酸断片であるオリゴヌクレオチドプローブを利用します。

原理

FISHの根幹を成すのは、核酸分子が持つ相補的な配列同士が特異的に結合する性質（ハイブリダイゼーション）です。あらかじめ標的としたい特定の遺伝子配列やRNA配列に相補的な配列を持つように設計・合成されたオリゴヌクレオチドプローブに、蛍光色素などの検出可能な標識を付加します。この標識プローブを試料に適用すると、プローブは試料中の相補的なターゲット配列にのみ結合します。非特異的に結合したプローブを洗い流した後、蛍光顕微鏡を用いて観察することで、プローブが結合した、すなわち目的の核酸配列が存在する位置や量、細胞などを検出することが可能になります。検出には、プローブに結合させた蛍光色素が発する蛍光を利用します。

手順

FISHを実施する際には、いくつかの主要なステップを踏みます。一般的な流れは以下の通りです。

1. 試料の準備と固定: 検査対象となる細胞や組織などの試料を準備し、構造や核酸を安定させるために固定を行います。固定には、細胞の形態を保ちつつ、核酸を損傷させないような方法が選択されます。例えば、微生物試料の固定にはパラホルムアルデヒドがよく用いられます。
2. 試料の処理: 固定された試料は、通常、フィルターなどの基質に固定されます。微生物学分野では、0.22 μm程度の孔径を持つフィルターに細胞を吸着させる方法が一般的です。これにより、後の処理が容易になり、細胞を観察に適した状態に保つことができます。
3. プローブとの反応（ハイブリダイゼーション）: 標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を試料に適用し、目的のターゲット配列とプローブが結合（ハイブリダイゼーション）するための適切な条件（温度、時間、バッファー組成など）で反応させます。このステップでは、プローブが非特異的な場所ではなく、ターゲット配列にのみ効率よく結合するように条件を最適化することが重要です。
4. 洗浄と観察: ハイブリダイゼーション反応後、プローブが特異的に結合しなかった部分を洗浄して除去します。これにより、ターゲット配列に結合したプローブからの蛍光シグナルのみが検出されるようになります。最後に、適切な波長の励起光を備えた蛍光顕微鏡を用いて試料を観察し、プローブが結合した位置や細胞を検出・可視化します。

用途と応用分野

FISHは、その高い特異性と、生体内の位置情報を保ったまま検出できるという利点から、様々な分野で活用されています。

医学・遺伝学分野

医学分野では、ヒトの染色体における特定の遺伝子の位置をマッピングしたり、染色体の構造異常（欠失、重複、転座など）や数の異常（異数性）を検出するために広く利用されています。細胞診や病理組織診断において、特定の疾患に関連する遺伝子異常の有無を確認する診断ツールとしても有効です。

微生物学分野

微生物学においては、特定の細菌や古細菌といった微生物を細胞レベルで識別し、その存在量や形態、群集内での空間配置を解析する強力な手法として用いられています。特に、真正細菌や古細菌が共通して持つリボソームRNA（rRNA）、具体的には16S rRNAや23S rRNAの配列は系統によって特異的な違いがあるため、これらの配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、様々な分類群の微生物を特異的に染色することが可能です。環境試料（土壌、水、消化管など）や臨床試料における微生物群集構造の解析に不可欠な技術となっています。

使用されるプローブと蛍光色素

FISHで使用されるプローブは、通常、20～30塩基程度の長さの合成オリゴヌクレオチドです。微生物学分野で広く用いられるrRNA標的プローブの他にも、検出対象に応じて様々な配列のプローブが設計されます。プローブの標識には、Cy3、Cy5、FITCなどの多様な蛍光色素が用いられます。複数の異なる蛍光色素で標識したプローブを同時に用いることで、一度の実験で複数の種類のターゲットや微生物を同時に検出することも可能です。

関連技術

FISHはin situハイブリダイゼーション技術の一つですが、その応用や関連する手法も開発されています。

CARD-FISH法 (Catalyzed reporter deposition - FISH): FISHのシグナル増幅を目的とした応用技術です。プローブに酵素を結合させ、この酵素の触媒反応によって大量の蛍光色素を沈着させることで、FISHの検出感度を飛躍的に向上させます。これにより、細胞内のターゲット配列のコピー数が少ない場合でも検出が可能となります。
全菌染色法: 試料中の全ての細胞を区別なく染色する手法です。DAPI、エチジウムブロマイド(EB)、SYBR Green Iなどが代表的な染色剤として用いられ、主に総細胞数の計測などに利用されます。FISHが特定の細胞を識別するのに対し、全菌染色法は全体像の把握に役立ちます。
生菌染色法: 生きている細胞と死んだ細胞を識別する手法です。CTCやCFDAなどが用いられます。FISHと組み合わせて行うことで、特定の種類の生きた細胞や死んだ細胞を区別して観察することも可能です。

さらに詳しく

FISHは、特定のターゲット配列をその場で検出できる強力な技術ですが、適切なプローブ設計と厳密な実験条件の管理が必要です。

[関連項目] In situ ハイブリダイゼーション
[外部リンク]
細菌のFISHに関する多数の論文が掲載されるサイト: Applied and Environmental Microbiology
* プローブの特異性を確認できるデータベースツール: Ribosomal Database ProjectⅡ

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