In situ ハイブリダイゼーション

in situ ハイブリダイゼーション (ISH)

in situ ハイブリダイゼーション（略称: ISH）は、細胞や組織の構造を保ったまま、その内部に存在する特定の核酸（DNAやmRNA）の位置や量を調べるための強力な分子生物学的手法です。「in situ」とはラテン語で「その場で」を意味し、この技術の最大の特徴である、核酸を細胞から抽出・分離することなく、本来の場所で検出できることを示しています。

原理

この技術の基本原理は、核酸分子が持つ塩基配列の「相補性」を利用した特異的な結合、すなわちハイブリダイゼーションです。検出したいターゲットとなるDNAやmRNAの特定の配列に特異的に結合するように人工的に合成された短い核酸分子を「プローブ」と呼びます。このプローブは、ターゲット配列と厳密に相補的な塩基配列を持つように設計されており、適切な条件下でインキュベートすることで、細胞内の目的の核酸にのみプローブが結合します。この結合したプローブを検出することで、ターゲット核酸の存在場所や量を特定します。

他の核酸検出法との比較

DNAやRNAの検出法として、サザンブロッティングやノーザンブロッティングといった手法もあります。これらはまず細胞や組織から核酸を抽出し、電気泳動で分離してからメンブレンに転写してプローブを用いて検出する方法です。これに対し、ISHは核酸を抽出せず、細胞や組織の形態情報を保ったまま解析できる点が大きく異なります。これにより、どの細胞が特定の遺伝子を発現しているか、細胞内のどこに特定の遺伝子やmRNAが存在するかといった詳細な空間情報が得られます。

また、タンパク質の分布や量を調べる免疫染色法と比較すると、免疫染色がタンパク質を検出するのに対し、ISHは主にmRNAを検出します。mRNAはタンパク質が作られる前段階の分子であるため、遺伝子発現の初期段階や、翻訳されないRNA分子（ノンコーディングRNAなど）の検出に適しています。

プローブの種類と設計

ISHに用いられるプローブとしては、DNAプローブやRNAプローブが古くから用いられてきました。近年では、ペプチド核酸（PNA）やLNA（Locked Nucleic Acid）といった、天然の核酸とは異なる構造を持つ人工核酸も使用されています。これらの人工核酸プローブは、天然核酸に比べてターゲットとの結合力が強く、より短い配列でも高い感度と特異度が得られるため、分解酵素の影響を受けにくいといった利点もあります。

プローブがターゲットに特異的に結合するためには、ハイブリダイゼーションの条件設定が重要です。特に温度は、プローブとターゲットの結合の強さを示す融解温度（Tm値）を考慮して決定されます。一般的に、Tm値より少し低い温度で反応を行いますが、温度が低すぎると非特異的な結合が増え特異度が低下し、温度が高すぎると目的の結合も不安定になり感度が低下します。より高い感度と特異度を両立するためには、Tm値が高くなるようにプローブを設計することが有効です。プローブの長さを調整したり、先に述べたRNAやPNAといったTm値の高い核酸分子を用いることで、適切なハイブリダイゼーション条件を設定しやすくなります。

プローブの標識と検出

プローブがターゲット核酸に結合したことを可視化するために、プローブには検出可能な標識が施されます。標識方法には大きく分けて二つあります。

1. 放射性標識: プローブ合成時に放射性同位体（例: 32P, 35S）を取り込ませる方法です。結合したプローブは、感光フィルムを用いたオートラジオグラフィーによって検出されます。感度が高い一方で、放射性物質の取り扱いに注意が必要であることや、検出に時間がかかるという側面があります。
2. 非放射性標識: ジゴキシゲニン（DIG）やフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ビオチンなどの分子をプローブに結合させる方法です。結合したプローブは、これらの標識分子に対する抗体（抗DIG抗体など）を利用した免疫組織化学的な手法で検出されます。抗体に酵素（アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ）や蛍光色素を結合させておくことで、発色反応や蛍光シグナルとして可視化します。

歴史的には放射性標識が先行しましたが、近年では非放射性標識プローブの感度が大幅に向上し、安全性の高さや、複数の異なる標識を用いることで複数のターゲットを同時に検出できる蛍光多重染色が可能になったことから、非放射性標識を用いたISHが広く普及しています。非放射性標識の検出に用いられる酵素としてはアルカリフォスファターゼ（AP）がよく用いられます。APは、NBT/BCIPなどの基質を分解して不溶性の有色沈殿を生成するため、光学顕微鏡で容易に観察できます。ペルオキシダーゼ（POD）も用いられますが、ISHの免疫組織化学的な検出においてはAP系の方が感度が高いとされています。

応用と関連技術

ISHは、ウイルス感染や腫瘍細胞における病原体DNAや癌関連遺伝子のmRNA検出といった病理診断に利用されるほか、発生生物学における特定の遺伝子の発現パターン解析、神経科学における脳組織の遺伝子発現マップ作成など、生命科学研究の様々な分野で不可欠なツールとなっています。

ISHを基盤とした関連技術も多く開発されています。代表的なものとして、蛍光標識したプローブを用いて染色体上の特定の遺伝子や配列を検出する蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）や、組織全体を透明化するなどして切片を作らずに個体や臓器全体で遺伝子発現を解析するWhole-mount in situ hybridization（WISH）などがあります。また、in situ PCRのように、ISHとPCRを組み合わせることで、微量なDNA/RNAをその場で増幅してから検出する高感度な手法も存在します。

まとめ

in situ ハイブリダイゼーションは、細胞や組織の微細な構造を維持したまま、特定の核酸分子の局在や量を高感度かつ特異的に解析できる、分子生物学研究および病理診断において非常に重要な技術です。プローブ設計、標識方法、検出系の進化により、その応用範囲はますます広がっています。

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