RFLP

RFLP（制限酵素断片長多型）とは？

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism、制限酵素断片長多型）は、生物個体間でゲノムDNAの制限酵素断片長に違いがあることを利用した遺伝子解析技術です。この違いは、DNA配列の一塩基多型（SNP）などによるもので、遺伝病の有無を判別する診断ツールや、原因遺伝子の特定に用いられます。

従来法とPCR-RFLP法

従来のRFLP法は、煩雑な手順を必要としていました。まず、生きた細胞を採取し培養した後、高品質なDNAを抽出し、制限酵素で切断、電気泳動、ブロッティング、プローブを用いたハイブリダイゼーション、そしてX線フィルムを用いた検出という工程を経ていました。この過程には数日を要し、熟練の技術と特殊な機器を必要としていました。

一方、ゲノムプロジェクトの進展によりPCR技術が発展し、PCR-RFLP法が確立されました。PCR-RFLP法では、まずPCR法を用いてDNAを増幅します。この増幅されたDNAを制限酵素で切断し、電気泳動を行い紫外線で可視化することで、RFLP解析が実施できます。従来法と比較して、DNA抽出の品質要求が低く、操作も簡便で、数時間程度で結果が得られるため、迅速かつ効率的な解析が可能となりました。

PCR-RFLP法の手順

PCR-RFLP法は、以下の手順で行われます。

1. DNA採取: 比較的粗雑な方法でもDNA採取が可能です。血液や口腔粘膜などのサンプルからDNAを抽出します。
2. PCR: 特定の遺伝子領域を増幅します。適切なプライマー設計が重要です。
3. 制限酵素処理: PCR産物を制限酵素で切断します。制限酵素の種類によって、切断される部位、そして断片の長さが異なります。
4. 電気泳動: 切断されたDNA断片を電気泳動によってサイズごとに分離します。サイズマーカーと比較することで、断片の長さを測定します。
5. 検出: エチジウムブロマイドなどの蛍光色素を用いてDNA断片を可視化します。

対立遺伝子の識別

RFLP解析では、断片長の差によって対立遺伝子を識別します。例えば、ある遺伝子座に制限酵素の認識部位が存在する場合と存在しない場合では、制限酵素処理後の断片長が異なります。この断片長の差を電気泳動で検出することで、それぞれの対立遺伝子を持つ個体を区別することができます。

下図は、サザンブロッティングを用いた従来法における対立遺伝子の識別方法の模式図です。個体Aと個体BのゲノムDNAを制限酵素SfaN Iで処理すると、個体Aでは2kbと1kbの断片が、個体Bでは3kbの断片が生成されます。サザンブロッティングの結果、個体Aでは2kbの位置に、個体Bでは3kbの位置にバンドが検出されます。このように、断片長の差によって対立遺伝子を識別することが可能です。

[図解：個体Aと個体BのゲノムDNAと制限酵素処理後の断片長、サザンブロッティングの結果を示す模式図を挿入]

まとめ

RFLPは、遺伝子診断や原因遺伝子の特定に有用な技術です。PCR-RFLP法の開発により、簡便かつ迅速な解析が可能となり、医学研究や遺伝子工学において広く活用されています。しかし、一塩基多型（SNP）などのより精度の高い手法の開発も進んでいるため、RFLPはそれらと比較検討しながら適切に利用されるべきです。

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