ウイルス定量

ウイルスの定量：目的と主要な手法

ウイルスの定量とは、特定の容量に含まれるウイルス粒子数を測定することを指します。このプロセスは、産業界や学術界における研究開発（R&D）だけでなく、医薬品製造などの多様な工程でウイルスの量が鍵となるため、非常に重要視されています。

例えば、ウイルスワクチンや、ウイルスベクターを用いた組換えタンパク質、ウイルス抗原などの生産においては、生産効率を最大限に高め、市場や用途の変化に柔軟に対応するために、製造プロセスの継続的な監視や調整が欠かせません。この目的達成のために、ウイルスの定量は不可避となります。

また、特定の既知ウイルスを定量化する必要がある具体的な場面としては、目的のウイルス株を選別するクローンスクリーニング、細胞へのウイルス感染効率を最適化する感染多重度（MOI）の設定、さらには細胞培養方法の改良などが挙げられます。これらの応用例において、正確なウイルス濃度情報は実験結果の信頼性や生産効率に直結します。

本記事では、液体サンプル中のウイルスを定量化するために現在一般的に用いられている様々な手法についてご紹介します。これらの手法は、大きく「従来法」と「最新法」の二つのカテゴリに分類できます。

従来法は、長年にわたり業界標準として利用されてきた確立された方法論ですが、一般的には結果を得るまでに多くの時間と手間を要する傾向があります。対照的に、最新法は比較的最近開発された市販の製品やキットを用いた方法で、定量にかかる時間を大幅に短縮できる特長があります。ただし、ここではすべての定量法を網羅的に解説するのではなく、代表的な従来法と新しい市販手法に焦点を当てて説明します。非商用の独自開発手法など、他にも公開されている定量法は存在しますが、本記事では扱わない点にご留意ください。

従来法

従来法には、主に以下のような手法が含まれます。

プラークアッセイ

プラークベースのアッセイは、ウイルスの感染力価に基づいてウイルス濃度を測定する、標準的な手法の一つです。この方法では、ウイルスサンプル中に存在するプラーク形成単位（pfu）の数を測定し、ウイルス量の一つの尺度とします。

プラークアッセイは、微生物学的手法であり、通常ペトリ皿やマルチウェルプレートで行われます。具体的には、まず宿主細胞を培養して密集した単層を形成させます。そこに段階的に希釈したウイルスサンプルを感染させ、その後、寒天やカルボキシメチルセルロースなどの半固体培地で細胞表面を覆います。これにより、ウイルス感染が局所的な範囲に留まり、際限なく広がるのを防ぎます。

ウイルスに感染した細胞は破壊（溶解）され、放出されたウイルス粒子が隣接する細胞に感染を広げます。この「感染→複製→溶解→感染拡大」のサイクルが繰り返されることで、感染領域が拡大し、最終的に周囲の無傷な細胞に囲まれた細胞溶解領域、すなわち「プラーク」が形成されます。このプラークは、光学顕微鏡下や、細胞染色を行うことで肉眼でも観察できるようになります。

プラークを可視化するための一例として、半固体の重層培地を取り除いた後、クリスタルバイオレット溶液などで細胞を染色し、溶解して死滅した細胞がある位置を無色部分として際立たせる操作が行われます。プラークが十分に形成されるまでにかかる時間は、分析対象のウイルスの種類によって異なり、3日から長い場合は14日程度を要することがあります。

形成されたプラークは、通常手作業で数えられます。得られたプラーク数にサンプルを調製する際に用いた希釈倍率を乗じることで、サンプル単位体積（通常1 mL）あたりのプラーク形成単位数（pfu/mL）が計算されます。このpfu/mLという値は、サンプル中に含まれる感染性ウイルス粒子の数を表す指標となります。ただし、この測定法は「形成されたそれぞれのプラークが、元のサンプル中の1つの感染性ウイルス粒子に由来する」という仮定に基づいています。プラークアッセイは、標準的な手法である反面、結果を得るまでに時間がかかり、作業者の熟練度や労力を必要とする側面もあります。

フォーカス形成アッセイ（FFA）

フォーカス形成アッセイ（FFA）も、プラークアッセイと類似した感染力価測定法ですが、大きな違いはウイルス抗原に特異的な蛍光標識抗体を用いて感染細胞を検出する点にあります。この手法は免疫染色技術を応用しており、細胞が溶解する前に感染した宿主細胞や感染ウイルス粒子を検出することができます。

FFAは細胞溶解を必須としないため、プラーク形成能を持たない、あるいは細胞膜の溶解を伴わないウイルス種の定量に特に適しています。操作としては、プラークアッセイと同様に、単層培養した宿主細胞に段階希釈したウイルスサンプルを感染させます。その後、ウイルス感染の局所的な拡散を抑えるために半固体の重層培地の下で、比較的短い培養時間（例えば24時間から72時間程度）インキュベートします。これにより、感染細胞の集まりである「フォーカス（病巣）」が形成されます。

培養後、プレートをウイルス抗原に対する蛍光標識抗体で染色します。蛍光顕微鏡を用いてフォーカスの数を数え、その数を基にウイルスを定量します。FFA法は、多くの場合プラークアッセイや50%組織培養感染量（TCID50）アッセイよりも短時間で結果が得られる利点があります。しかし、必要な試薬（特に蛍光標識抗体）や高価な蛍光顕微鏡が必要となるため、コストが高くなる傾向があります。また、測定時間は、作業者がカウントする視野のサイズに依存します。広い視野をカウントすればより正確な値が得られますが、その分時間もかかります。FFAの結果は、通常ミリリットルあたりのフォーカス形成単位（FFU/mL）として表現されます。

限界希釈法 (TCID50)

50%組織培養感染量（50% Tissue Culture Infective Dose, TCID50）は、ウイルスの感染力価を示す指標の一つです。TCID50は、接種した組織培養細胞の50%を感染させて細胞変性効果を引き起こす、あるいは死滅させるのに必要なウイルス量を定量します。この手法は、臨床研究でウイルスの致死量を評価する必要がある場合や、プラークを形成しないウイルスの定量によく用いられます。

組織培養を用いた操作例としては、まず宿主細胞を播種し、様々な段階で希釈したウイルスサンプルを添加して培養します。一定時間培養した後、ウイルス感染によって死滅または変性した細胞（感染細胞）の割合を目視で観察します。各希釈段階における感染細胞の割合を記録し、その結果から数学的な計算（一般的にスピアマン・カーバー法やリード・ミュンヒ法などが用いられます）によってTCID50の値を算出します。

TCID50とPFU/mL、あるいは他の感染性アッセイの結果は、測定方法や原理が異なるため、必ずしも等価ではありません。TCID50法は細胞の感染が必要であり、結果が得られるまでに最大で1週間程度かかることがあります。

TCID50とPFUの関係については、ポアソン分布に基づくと約0.69 PFUが1 TCID50に相当するという推定がよく知られています。しかし、実際には同じウイルスと細胞の組み合わせであっても、測定条件（細胞の状態や培地など）によってこの関係は変動しうるため、あくまで目安として捉えるべきです。信頼性の高いPFU数は、実験的に決定されることが推奨されます。

タンパク質定量

ウイルスの定量にタンパク質を指標とする手法も複数存在します。これらの手法は、サンプル中の感染性ウイルス粒子数や全ウイルス粒子数を直接数えるのではなく、総タンパク質量または特定のウイルスタンパク質の量を測定します。多くの場合、蛍光検出を利用して定量が行われます。

タンパク質定量法には、サンプル中のタンパク質を直接測定するものと、分析前に宿主細胞にウイルスを感染・増殖させてから細胞やウイルス粒子を溶解し、タンパク質を抽出して定量するものがあります。採用する測定法は、サンプル中のウイルスタンパク質の量と測定法自体の感度によって選択されます。ウイルス増殖を伴う場合、分析前に細胞やウイルスを効率よく溶解・分解する処理が行われることが一般的です。

ほとんどのタンパク質ベースの測定法は比較的迅速に結果が得られ、高い感度を持っています。しかし、正確な定量には既知濃度の標準品が必要です。また、これらの手法が測定するのはタンパク質量であり、実際のウイルス粒子濃度を直接反映するわけではないという限界があります。特に、宿主細胞由来のタンパク質が混入している場合、正確なウイルスタンパク質量を測定するためには混入レベルを極めて低く抑える必要があります。

広く利用されているタンパク質ベースの定量法の代表例を以下に示します。

血球凝集アッセイ (HA): インフルエンザウイルスの定量などで代表的な非蛍光測定法です。インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニンが赤血球を凝集させる性質を利用します。インフルエンザサンプルの希釈液と赤血球溶液を混合し、凝集が最初に観察されるウイルス希釈度を目視で確認します。結果は血球凝集単位（HAU）で表されます。測定には1～2時間程度かかりますが、結果は測定者の技術や経験に左右されることがあります。血清中のインフルエンザ特異抗体濃度を測る血球凝集阻害アッセイ（HI）もHAアッセイの一種です。
ビシンコニン酸アッセイ (BCA): 最も一般的な総タンパク質定量法のひとつで、簡便な比色測定に基づいています。タンパク質によって還元された銅イオンがBCA試薬と反応し、特有の色（562 nmに吸収を持つ）を呈することを利用します。検量線と比較してサンプル中の総タンパク質濃度を測定します。分析時間は30分～1時間程度です。汎用性が高く高速ですが、ウイルス由来タンパク質だけでなくサンプル中の全てのタンパク質を定量するため、ウイルスの特異的な定量には向きません。
一元放射状免疫拡散法 (SRID): マンチーニ法とも呼ばれ、半固体培地（寒天）中での拡散を利用して特定のウイルス抗原量を検出する手法です。目的の抗原に対する抗体を含む培地を用意し、その中央に抗原サンプルを含むディスクを置きます。抗原は培地中に放射状に拡散し、抗体と反応して免疫沈降のリングを形成します。このリングの直径は抗原（タンパク質）濃度の対数と直線関係にあるため、既知濃度の標準品と比較することで定量できます。測定に要する時間は、抗原と抗体の反応時間によって10時間から数日と幅があります。

透過型電子顕微鏡 (TEM)

透過型電子顕微鏡（TEM）は、電子線をサンプルに透過させて高解像度の画像を得る電子顕微鏡の一種です。光学顕微鏡をはるかに凌ぐ高い空間分解能（通常0.2 nm程度）を持ち、個々のウイルス粒子を直接観察することが可能です。

TEMで観察するためには、通常、極めて薄くしたネガティブ染色のサンプルが必要です。サンプル準備には、TEMグリッドと呼ばれる金属板の上に標本を載せ、電子線を通しにくい物質（ネガティブ染色剤）で処理するなどの工程が含まれ、プロトコルや実験者によって異なりますが、一般に数時間かかります。組織中のサンプルを検査する場合は、薄く切片化する必要があります。

TEM画像は個々のウイルス粒子の詳細な形態情報を提供するとともに、定量的画像解析によってサンプル中のウイルス濃度を測定することも可能です。この手法で定量されるのは、感染力があるかどうかにかかわらず、視野内に存在するすべてのウイルス様粒子（vlp/mL）の数です。そのため、TEMによる定量結果は、感染性粒子のみを測定するアッセイの結果よりも大きな値になることが多いです。

定量的TEMは、通常10^6粒子/mLを超える比較的高いウイルス濃度での測定に適しています。また、機器自体のコストが非常に高く、設置に必要なスペースや専門的なサポート施設も必要となるため、利用できる施設は限られています。

最新の分析法

近年開発された、迅速かつ高精度なウイルス定量法には、以下のようなものがあります。

調整可能抵抗パルスセンシング（TRPS）

調整可能抵抗パルスセンシング（TRPS）は、個々のウイルス粒子がサイズ調整可能なナノポアを一つずつ通過する際に生じる電気抵抗の変化を測定する技術です。このシングル粒子測定により、溶液中のウイルス粒子のサイズと濃度（総ウイルス粒子濃度 vp/mL）を同時に、かつ高解像度で測定できるという大きな利点があります。サンプルの安定性を評価したり、凝集体の状態を確認したり、総ウイルス粒子濃度を決定したりするのに有用です。

TRPSによる測定はイオン性緩衝液中で行われ、蛍光色素などを用いた事前の染色処理は不要です。このため、他の前処理が必要な手法に比べて迅速であり、サンプルあたりの準備時間と測定時間を合わせても10分以下で完了することが可能です。TRPSを用いたウイルス分析システムは市販されており（例：qViro-Xシステム）、測定後にオートクレーブ処理でサンプルを不活化できる点も実用上の利点です。

フローサイトメトリー

多くの一般的なフローサイトメーターは、ウイルスのサイズが小さすぎるため定量に十分な感度を持ちませんが、ウイルス定量に特化した高感度なフローサイトメーターが一部市販されています。これらの「ウイルスカウンター」は、ウイルス粒子を構成するタンパク質と核酸の両方に結合する蛍光色素を用いてサンプルを染色し、粒子がレーザー光を通過する際に発生する蛍光信号を検出することで、サンプル中の完全なウイルス粒子数を定量します。

サンプルは、タンパク質に特異的な色素と核酸に特異的な色素の2種類で染色された後、流路中を高速で流されます。ウイルス粒子は両方の色素で同時に染色されるため、2つの異なる蛍光チャンネルで同時に検出された粒子をカウントします。この粒子数と測定されたサンプルの流量から、ウイルス粒子の濃度（vp/mL）が計算されます。この手法で得られる結果は、多くの場合TEMによる測定結果と近い値を示します。

ウイルスカウンターを用いたフローサイトメトリーは、通常10^5から10^9 VP/mLの範囲で優れた直線性を示します。分析時間自体は約10分と短く、サンプル調製時間も比較的短いのが特徴です。

定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）

定量PCR（qPCR）は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてウイルス由来のDNAまたはRNA配列を増幅し、その増幅産物をリアルタイムで蛍光検出・定量する分析法です。この手法では、未知の濃度を持つサンプルと、既知濃度で段階希釈した標準サンプルを同時に分析し、標準サンプルの結果から作成される検量線を用いて未知サンプルの核酸量を定量します。

定量的な検出には、配列特異的な蛍光プローブ（TaqMan®プローブなど）や、すべての二本鎖DNAに結合して蛍光を発する非特異的な色素（SYBR® Greenなど）が利用されます。配列特異的なプローブは、増幅された目的配列にのみ結合して蛍光を発するため、非特異的な増幅産物の影響を受けにくく、より特異的で高感度な検出が可能です。qPCRには、増幅産物が統計的に有意な増加を示したPCRサイクル数（Ct値）を比較することで相対定量を行う比較しきい値法など、様々なバリエーションが存在します。

qPCRは、完全な感染性ウイルス粒子（ビリオン）に含まれる核酸だけでなく、破損したウイルス粒子や溶液中に存在する遊離の標的核酸も含めて、検出対象のすべての核酸配列を増幅します。そのため、qPCRの結果は通常ゲノムコピー数/mL（GC/mL）として表され、TEMなど粒子数をカウントする手法の結果よりも大きな値になることが多いです。

ウイルス定量における核酸コピー数と完全なビリオン数の比率は、必ずしも1対1ではありません。これは、ウイルス複製過程で核酸とウイルスタンパク質の生成比率が変動したり、ウイルスの組み立てプロセスにおいて完全なビリオンだけでなく、空のキャプシドや過剰な遊離ゲノムが生じたりするためです。例えば、口蹄疫ウイルスの場合、活発に複製している宿主細胞内では、全ビリオン数に対してRNAコピー数が約1000倍になることも報告されています。

qPCRベースのウイルス定量用製品は、多くのメーカーから市販されています。この手法の大きな利点は、分析時間の短さ（1～4時間程度）と、他の方法では検出が困難な非常に低濃度のウイルスでも検出できる高い感度です。

酵素免疫測定法（ELISA）

ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）は、酵素に結合させた特定の抗体を利用して、サンプル中に存在する未知量の抗原（この文脈ではウイルス由来のタンパク質や粒子）を検出・定量する、比較的モダンなタンパク質検出法です。サンプル中の抗原濃度に応じて、酵素が特定の試薬を検出可能な信号（発色や蛍光など）に変換することで、抗原抗体反応に基づいた結合量を定量します。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）は、信号を増幅し、分析法の感度を高めることができるため、ELISAでよく利用される酵素の一つです。ELISA法には多くの種類がありますが、一般的には直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法、逆ELISA法などに分類されます。ELISAキットは多くの企業から市販されており、定量は通常、発色や蛍光の変化を測定することで行われます。

この手法は、古典的な免疫拡散法などに比べて必要な労力が少なく、比較的簡便に行えます。測定に要する時間は、抗体と抗原のインキュベーション時間などによって異なりますが、概ね4時間から24時間程度です。

まとめ

ウイルスの定量手法は多岐にわたり、それぞれが異なる測定原理に基づいています。プラークアッセイやFFA、TCID50は感染性粒子数を測定するのに対し、TEMやTRPS、フローサイトメトリーは全粒子数を測定します。qPCRは核酸コピー数を、ELISAや他のタンパク質定量法は特定の抗原または総タンパク質量を測定します。

各手法には、所要時間、コスト、必要な機器、感度、特異性などの点で利点と限界があります。ウイルスの種類、測定目的（研究、製造、診断など）、求められる精度や迅速性、利用可能な設備などを考慮し、最適な定量法を選択することが重要です。

参考文献

ATCC - Converting TCID50 to plaque forming units PFU-124 (※入力情報に基づくが、原文のままの記載とする)

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