定量PCR

定量PCRとは

定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction, Q-PCR）は、従来のPCR法をさらに発展させた技術であり、DNA、cDNA、あるいはRNAといった特定の核酸配列がサンプル中にどれだけ存在するかを定量的に測定することを可能にします。通常のPCRが増幅された最終産物を確認するのに対し、定量PCRは反応の過程で増幅される産物の量をリアルタイムに、あるいは反応終了後に測定することで、反応を開始する時点での標的核酸の初期量を間接的に推定します。この技術は、特定の遺伝子の発現量を調べたり、病原体のDNA量を検出・測定したり、遺伝子改変生物のスクリーニングを行ったりするなど、生命科学研究や診断分野で幅広く利用されています。

基本的な原理は、PCRの指数関数的な増幅を利用する点では通常のPCRと同じですが、増幅反応の各サイクルまたは特定の時点での産物量をモニタリングする仕組みが加わっています。反応開始時の標的分子が多いほど、増幅曲線は早期に立ち上がり、目的の産物が一定量に達するまでのサイクル数が少なくなります。この「サイクル数」と「初期量」の相関関係を利用して定量が行われます。

定量PCRには、主に三つの異なる定量方法が存在します。それぞれの方法には、感度、特異性、リアルタイム性、および操作の難易度などに違いがあります。

主な定量方法

定量PCRで一般的に用いられる主な分析手法は以下の三種類です。

アガロースゲル電気泳動法

この方法は、最も単純で基本的な定量手法の一つです。PCR反応終了後に増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、目的のバンドの濃さを測定することで定量を行います。

原理: 既知濃度の標準試料を用いて作成した検量線や、同一ゲル上で泳動した既知濃度のDNA断片と比較することで、未知試料中の標的核酸の相対的な量を推定します。
特徴: 操作は比較的容易ですが、リアルタイムでの測定はできません。結果が得られるまでに時間がかかり、感度も他の方法に比べて低い傾向があります。また、ゲルの状態やバンド染色の均一性に結果が左右されやすいという欠点があります。厳密な意味での「定量」というよりは、「半定量」や単なる「存在確認」に用いられることが多く、現在ではより高性能なリアルタイム定量法に取って代わられつつあります。
手順:
1. 濃度が既知の標準試料と測定したい未知試料を用意する。
2. 同じ条件（プライマー、温度プロファイルなど）でPCR反応を行う。
3. PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分離する。
4. ゲル上で目的バンドの濃さを測定し、標準試料と比較して未知試料の相対量を算出する。

SYBRグリーン法

SYBRグリーン法は、アガロースゲル法よりも正確で、リアルタイムでの定量が可能な手法です。この方法では、二重鎖DNAと結合すると蛍光を発する色素（代表的なものがSYBRグリーン）をPCR反応液に加えます。

原理: PCRの進行によって増幅され、新たに生成された二重鎖DNAに色素が結合することで蛍光強度が増加します。この蛍光強度の変化をリアルタイムでモニタリングすることで、反応液中の二重鎖DNA量の増加を追跡し、そこから初期の標的核酸量を定量します。
特徴: リアルタイム定量が可能であるため、反応過程をモニタリングできます。ゲル法に比べて感度や正確性は向上しますが、SYBRグリーン色素は目的の標的配列以外にも、プライマーダイマーなど非特異的に生成された二重鎖DNAにも結合して蛍光を発してしまうという欠点があります。このため、非特異的な増幅があると正確な定量が困難になる可能性があります。
手順:
1. SYBRグリーンなどの二重鎖DNA結合色素を加えてPCR反応を行う。
2. PCRサイクルの進行に合わせて、リアルタイムで蛍光強度を測定する。
3. 得られた蛍光シグナルと既知濃度の標準試料のデータと比較し、標的核酸の初期量を定量する。

蛍光プローブ法

蛍光プローブ法は、定量PCRの中で最も特異性が高く、正確で信頼性の高い方法とされています。この方法では、プライマーに加えて、増幅領域内の特定の配列に相補的に結合する蛍光標識プローブを使用します。

原理: 使用するプローブは、通常、蛍光を発するレポーター色素と、その蛍光を消光する（抑制する）クエンチャー色素を両端に持ちます。プローブが無傷な状態では、レポーターとクエンチャーが近接しているため蛍光は抑制されています。PCR反応が進行し、DNAポリメラーゼがプライマーから新しいDNA鎖を合成してプローブの位置に達すると、多くのDNAポリメラーゼが持つ5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解されます。プローブが分解されてレポーターとクエンチャーが引き離されると、レポーター色素からの蛍光が観測できるようになります。標的配列が増幅されるにつれてプローブの分解も進み、蛍光強度が幾何級数的に増加します。この蛍光増加量を測定することで、反応開始時の標的核酸量を非常に正確に定量することが可能です。
特徴: 特定の配列にのみ結合するプローブを用いるため、SYBRグリーン法のような非特異的な増幅による影響を受けにくく、高い特異性と信頼性が得られます。リアルタイムでの測定が可能であり、複数の異なる標的配列を同時に定量するマルチプレックス解析も比較的容易に行えます。ただし、プローブの設計・合成が必要となるため、SYBRグリーン法に比べてコストが高くなる傾向があります。
* 手順:
1. 蛍光プローブを加えてPCR反応を行う。
2. DNAが一本鎖に解離すると、プローブが相補的な鋳型配列に結合する。
3. DNAポリメラーゼが新しい鎖の合成を開始し、プローブの位置に到達する。
4. ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解され、レポーターとクエンチャーが分離する。
5. 分離したレポーターからの蛍光をリアルタイムで測定する。
6. 蛍光シグナルの増加を解析し、既知濃度の標準試料と比較して標的核酸の初期量を定量する。

これらの方法の中から、実験の目的、必要な精度、利用可能な機器などを考慮して最適な方法が選択されます。近年では、リアルタイムでの測定が可能で、かつ高精度なSYBRグリーン法や蛍光プローブ法が定量PCRの主流となっています。

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