コメットアッセイ

コメットアッセイ（comet assay）

コメットアッセイは、化学物質などが生体に与える影響を評価する手法の一つで、特に遺伝毒性（細胞の遺伝物質であるDNAに損傷を与える性質）を検出するために広く用いられています。正式名称は単細胞ゲル電気泳動法（Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE）とも呼ばれ、個々の細胞におけるDNAの損傷度合いを視覚的に評価することが可能です。

この手法は、電気泳動の原理を応用しています。通常、真核生物の細胞核内に存在するDNAは、複雑に折り畳まれた高次構造を形成しており、そのままでは電気的な力で移動することはありません。しかし、DNAに切断や損傷が生じると、その構造が緩み、ある程度自由に動けるようになります。

この現象を利用して、細胞をアガロースゲル内に埋め込み、電気を流します。損傷を受けたDNAは、マイナスの電荷を帯びているため、電気泳動の陽極側へと移動します。この移動したDNA部分を、DNAと結合する性質を持つ蛍光色素で染色し、蛍光顕微鏡で観察すると、損傷を受けていない核の部分が明るい球状に見えるのに対し、損傷DNAが移動した部分は核から尾を引いたような形に見えます。この様子が彗星（コメット）に似ていることから、「コメットアッセイ」という名前が付けられました。

コメットアッセイは、遺伝毒性評価だけでなく、細胞がプログラムされた死を迎えるアポトーシスの検出にも利用されます。アポトーシスの過程では、特徴的にDNAが一定の長さに切断されるため、コメットアッセイを適用すると、DNAの大部分が核から大きく離れて移動し、顕微鏡下では涙滴のような独特の形態を示すことがあります。アポトーシス検出に特化したこの観察法は、「teardrop assay（涙滴アッセイ）」とも呼ばれます。通常のDNA損傷とは異なり、アポトーシス細胞では損傷の程度に中間段階が見られにくいという特徴があります。

歴史的には、当初は中性条件での電気泳動によりDNAの二本鎖切断を検出する手法として開発されました。その後、泳動前処理と泳動をアルカリ性（pH 13以上）で行う方法が発表され、このアルカリ法によりDNAの一本鎖切断や、DNA修復過程で生じるアルカリ感受性部位なども検出できるようになり、検出感度が飛躍的に向上しました。このアルカリ法が現在のコメットアッセイとして広く普及しています。

他の従来のDNA損傷検出法と比較して、コメットアッセイにはいくつかの長所があります。例えば、アルカリ溶出法（AEA）は多量の細胞が必要ですが、コメットアッセイはより少量の細胞で実施可能です。姉妹染色分体交換法（SCE）は細胞レベルの評価が可能ですが、手法が煩雑で時間を要します。不定期DNA合成試験（UDS）は同位体を使用する必要があり、感度もそれほど高くありません。また、umuアッセイは細菌を用いた手法であり、真核生物への結果の外挿性に限界があります。これらに対し、コメットアッセイは比較的簡便に細胞レベルでのDNA損傷を検出でき、培養細胞を用いたin vitro試験だけでなく、動物組織を用いたin vivo試験にも適用できます。アポトーシス細胞の特徴的な形態を容易に観察できることも大きな利点です。

一方で、短所としては、強い細胞毒性によって二次的にDNA損傷が引き起こされ、遺伝毒性の偽陽性を示す可能性がある点が挙げられます。そのため、コメットアッセイの結果を評価する際には、同時に細胞毒性の有無を確認することが重要です。

コメットアッセイの一般的な手順は以下の通りです。

1. 検査対象となる細胞または細胞核を準備します。組織を用いる場合は細かく分散（ホモジナイズ）させます。
2. これらの細胞または核を融解した低融点アガロースゲルに混ぜ、スライドグラスなどの支持体上に薄いゲルとして固めます。
3. 界面活性剤と高濃度の塩を含む緩衝液に浸し、細胞膜やタンパク質を溶解させます。
4. アルカリ性緩衝液に浸し、DNAを変性させます（アルカリ法の場合）。
5. アルカリ性緩衝液中で電気泳動を行います。
6. 中性緩衝液で中和します。
7. 臭化エチジウムなどの蛍光色素でDNAを染色します。
8. 蛍光顕微鏡を用いて観察します。
9. 各細胞の彗星状の尾の長さやDNA量などを指標に、DNA損傷の程度を評価します。評価は、目視による段階分類や、画像解析ソフトウェアを用いた半定量的な手法で行われます。

これらの手順を通じて、個々の細胞が受けたDNA損傷の度合いを定量的に評価し、物質の遺伝毒性や細胞のアポトーシス状態を調べることが可能になります。迅速かつ高感度な手法として、広く研究や安全性評価の分野で活用されています。

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