単粒子解析法

単粒子解析法 (Single Particle Analysis, SPA)

単粒子解析法は、三次元電子顕微鏡法の一分野であり、主に透過型電子顕微鏡（TEM）を活用して生体高分子やウイルスなどの微細な構造を詳細に解析する強力な手法です。この方法は、多数の単一粒子を様々な角度から撮影した二次元画像群を集め、高度な画像処理技術を駆使することで、従来の単一画像では得られなかった高い分解能での観察や、対象の精密な三次元立体構造の再構築を可能にします。特に近年、低温電子顕微鏡法（Cryo-EM）の発展や検出器性能、画像解析アルゴリズムの向上と相まって、原子レベルでの分解能達成も現実のものとなっています。

解析の基本的な考え方

透過型電子顕微鏡で生物試料のような繊細な物質を観察する際、強い電子線を当てると試料は容易に損傷してしまいます。そのため、試料へのダメージを最小限に抑えるために、ごく弱い電子線（低照射量）で撮影が行われます。しかし、弱い電子線では得られる画像信号（コントラスト）が小さく、試料を包埋している非晶質氷などから生じるノイズに埋もれやすいため、そのままでは対象の構造を鮮明に捉えることが困難です。

この問題を克服するため、単粒子解析法では、同一の対象粒子が写った画像を大量に収集します。そして、形状や向きが似ている画像をグループ化し、それらを互いに正確に重ね合わせて平均化する処理を行います。この平均化の過程で、ランダムなノイズ成分は打ち消され、共通して存在する対象粒子からの信号成分だけが強調されるため、画像の信号対雑音比（S/N比）が飛躍的に向上し、対象の微細な構造がより鮮明に浮かび上がってきます。

解析プロセス

単粒子解析は、一般的に以下の主要なステップを経て三次元構造再構築に至ります。

1. 画像データの取得

透過型電子顕微鏡を用いて、解析対象となる多数の粒子を含む視野を撮影します。この際、電子線照射量を低く抑え、試料が様々な方向を向いている状態の画像データを収集することが重要です。

2. 粒子画像の選択と前処理

撮影された画像の中から、解析対象となる個々の粒子が写っている領域を自動または手動で切り出します。切り出された多数の粒子画像は、以降の解析の出発点となります。

3. 画像の整列と分類 (Alignment and Classification)

切り出された粒子画像は、それぞれが異なる位置や角度、さらには異なる立体配座（形状変化）をとっている可能性があります。これらの画像を正確に解析するためには、まず各画像の相対的な位置ずれや面内回転を補正して揃える「整列」が必要です。整列には、相互相関法などの手法が用いられ、フィルタリングなどを活用して精度を高めます。

次に、同じグループとして平均化するために、互いに似た特徴を持つ画像を「分類」します。分類は、粒子の向きの違いだけでなく、構造的な多様性（例：タンパク質の異なるコンフォメーション）を区別するためにも行われます。多変量解析やクラスター分析（例：k平均法）といった統計的な手法がこの分類に利用されます。整列と分類を繰り返すことで、高S/N比の平均画像群（基準投影像）が得られます。

4. イメージフィルタリング (Image Filtering)

画像処理の様々な段階で、ノイズ除去や特定成分の強調を目的としたフィルタリングが適用されます。画像のフーリエ変換によって得られる逆空間（周波数空間）や、元の画像である実空間において、帯域通過フィルター（バンドパスフィルター）、低域通過フィルター（ローパスフィルター）、高域通過フィルター（ハイパスフィルター）などが状況に応じて使い分けられます。例えば、実空間では輪郭検出に用いられるSobelフィルターや、窓関数フィルター（ハン窓など）が利用されることもあります。

5. コントラスト伝達関数 (CTF) 補正

透過型電子顕微鏡の像は、真の試料構造に加えて、レンズの収差やデフォーカス量といった機器由来の特性によって引き起こされるボケやコントラストの反転などの影響を受けています。この影響を数学的に記述したものがコントラスト伝達関数（CTF）です。得られた画像から真の構造情報を正確に引き出すためには、画像に畳み込まれたCTFの影響を計算し、それを取り除く「CTF補正」が不可欠な処理となります。

6. 三次元構造の再構築 (3D Reconstruction)

整列・分類・CTF補正などを経て得られた高S/N比の平均画像群は、対象の粒子が様々な方向を向いた際の二次元投影像と解釈できます。これらの多様な方向からの投影像をコンピュータ上で統合し、元の三次元構造を計算によって「再構築」します。この再構築プロセスは、単粒子解析法の最終的な目標であり、ここから得られた三次元密度マップを解析することで、対象の詳細な分子構造を解明することができます。

ソフトウェアと応用

単粒子解析法を実行するためには、上述した複雑な画像処理と三次元再構築を効率的に行うための専門的なソフトウェアが不可欠です。Relion, EMAN2, FREALIGN, SPIDERなど、多くの解析ソフトウェアが開発され、研究者によって利用されています。

この手法は、リボソームやチャネルタンパク質といった巨大なタンパク質複合体、ウイルス粒子、細胞小器官など、結晶化が困難な生体高分子の構造解析において特に威力を発揮します。クライオ電子顕微鏡技術の進化とともに、近年では原子レベル、すなわち数オングストローム（Å）以下の分解能でこれらの構造を決定することが可能となり、生命科学分野における構造研究に革命をもたらしています。

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