逆転写ポリメラーゼ連鎖反応

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、通称RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）は、細胞内や検体中に存在するRNA分子を検出・増幅するための強力な分子生物学的手法です。この技術は、DNAを増幅する標準的なPCR法と、RNAの情報をDNAに変換する逆転写反応を組み合わせたものです。

なぜRT-PCRが必要なのか？

生命体における遺伝情報の流れは、通常DNAからRNA、そしてタンパク質へと一方的に進みます。一般的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、二本鎖DNAを鋳型として、特定の標的DNA領域を短時間のうちに大量に複製する技術です。この方法は、DNAの存在や量を調べたい場合には非常に有効ですが、DNAポリメラーゼという酵素はRNAを直接の鋳型としてDNAを合成することができません。したがって、PCRだけでは細胞や生物組織に含まれるRNA分子を検出することが不可能です。

しかし、細胞内で重要な役割を果たすメッセンジャーRNA（mRNA）や、多くのウイルスのゲノムとして存在するRNA分子の情報を解析したいというニーズは非常に高いです。例えば、細胞が特定の環境変化に応答してどの遺伝子の発現量（作られるmRNAの量）を変化させたかを調べたり、あるいはインフルエンザウイルスや新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のようなRNAウイルスに感染しているか診断したりするためには、RNAを検出・定量する技術が不可欠となります。RT-PCRは、このようなRNAを対象とした解析を可能にするために開発されました。

RT-PCRの基本的なステップ

RT-PCRは、名前が示すように、「逆転写（Reverse Transcription）」と「PCR」という二つの主要な反応から構成されます。

1. 逆転写反応（RNA → cDNA）
最初のステップは、対象となるRNA分子の情報をDNAの形に変換することです。この反応は「逆転写酵素（Reverse Transcriptase）」と呼ばれる特別なDNAポリメラーゼによって触媒されます。逆転写酵素は、RNA鎖を鋳型として、それに相補的な一本鎖DNA（これをcDNAと呼びます）を合成する能力を持っています。このcDNAは、元のRNA配列の情報をそのまま引き継いでいますが、DNAであるため後のPCRステップで鋳型として利用可能になります。逆転写反応を開始するためには、RNA分子に結合するプライマーが必要です。一般的には、mRNAのポリアデニル化テイルに結合するオリゴdTプライマー、あらゆるRNAにランダムに結合するランダムプライマー、または特定の標的RNA配列に特異的に結合する配列特異的プライマーなどが使用されます。

2. PCR反応（cDNA → 増幅）
逆転写によって得られたcDNAは、次に標準的なPCR反応の鋳型として利用されます。ターゲットとする遺伝子領域に特異的なプライマーセットを設計し、耐熱性DNAポリメラーゼを用いてcDNA上の目的配列を指数関数的に増幅させます。DNAの変性、プライマーのアニーリング、DNA鎖の伸長という温度サイクルを繰り返すことで、逆転写によってわずかに合成された目的のcDNA配列を、高感度に検出できるレベルまで大量にコピーすることができます。

RT-PCRの主な応用分野

RT-PCR技術は、その高い検出感度とRNAを扱える特性から、生物学や医学分野で幅広く活用されています。

RNAウイルスの検出: レトロウイルスやフラビウイルス、コロナウイルスなど、ゲノムがRNAである多くのウイルスの感染診断において、RT-PCRは極めて重要な手法です。患者検体からウイルスRNAを抽出し、ウイルスの特定遺伝子配列に対するRT-PCRを行うことで、感染の有無を早期かつ正確に判定することが可能です。
遺伝子発現解析: 特定の細胞や組織で、ある遺伝子がどれだけ活発に働いているか（mRNAがどれだけ作られているか）を調べる研究（遺伝子発現解析）において、RT-PCRは不可欠なツールです。特に、増幅過程をリアルタイムでモニタリングする定量RT-PCR（RT-qPCR）は、複数のサンプル間でmRNA量を比較し、遺伝子の発現レベルの差を定量的に評価するために広く利用されています。
RNA情報の安定な保存: 細胞内のRNA分子、特にmRNAは非常に不安定で分解されやすい性質を持っています。一方、RT-PCRによってRNAから変換されたcDNAは、DNAとして存在するためはるかに安定しており、長期的な保存が可能です。貴重なRNAサンプルからcDNAライブラリを作成し、後の解析に備える目的でもRT-PCRが利用されます。

このように、RT-PCRはRNAを対象とした遺伝子解析を可能にし、病気の診断、基礎生物学研究、創薬研究など、多岐にわたる分野で重要な役割を果たしています。逆転写酵素やPCRといった関連技術の発展とともに、その応用範囲は広がり続けています。