DGGE

DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）について

DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）は、分子生物学の分野で広く用いられるDNA分離技術の一つです。この手法は、特に二本鎖DNAの断片を効率的に分離するために、特別なゲルを用いるという特徴があります。ゲルには変性剤の濃度勾配が設定されており、一般的にはポリアクリルアミドゲルを使用します。変性剤としては、尿素やホルムアミドが一般的です。

この技術の主な原理は、DNAの変性度と分子量の違いを利用することです。ゲル中では、変性剤の濃度が場所によって異なり、これにより二本鎖DNAの断片が異なる速度で移動します。具体的には、変性剤が多く含まれる部分ではDNAが変性しやすく、そこでは二本鎖DNAが分子量だけでなく変性しやすさによっても違った位置にバンドが現れるため、高い分離精度を確保することができます。

また、DGGEの技術革新の一つとして、GC clampという手法があります。これは、G-Cリッチな安定した配列をPCRのプライマーの5'側に付加するもので、これにより負荷電が維持され、分離能力が向上します。結果として、G-Cが豊富で長いDNAの解析が可能になります。ただし、GC clampを使用したプライマーは通常のプライマーよりも高価になります。

DGGEは、元々FisherとLermanによって提案された手法で、以降の研究によってメタゲノムの解析にも応用されています。環境中には多くの微生物が存在しますが、そのほとんどは培養が難しいため、DGGEを使うことで一度に多くの微生物を検出することが可能になります。複雑な微生物群集を試料にしても、高い分離能を持つため、得られたバンドは容易に切り出し、次後のシークエンシング反応に使用することができます。しかし、PCRで増幅した場合にキメラDNA産物が作られるリスクや、DNAポリメラーゼによるエラーが起こる可能性があるため、信頼性の高い結果を得るためには特別な処理が求められます。ですので、増幅エラーを避けるために、φ29DNAポリメラーゼなどを使用し、heteroduplexの検出を行うS1ヌクレアーゼや、配列の確認を行うキメラチェックプログラムが併用されています。

手順

以下に、DGGEの基本的な手順を示します。
1. プライマーの設計：GC clampは開裂のしやすい領域の近くに配置し、100〜400 bpの増幅領域には開裂する部分が1つか2つ含まれるように設計します。
2. 濃度勾配ゲルの作成：変性剤濃度が徐々に高くなるように設定したゲルを準備し、一定の温度下で15分間プレランします。
3. 電気泳動：サンプルをゲルにロードし、低電圧（50〜60V程度）で一晩泳動します。
4. 染色：染色剤には、従来の臭化エチジウムだけでなく、より感度の高いSYBR GoldやSYBR Green Iが使用されます。
5. バンドの切り出し：非常に細かいバンドができるため、滅菌されたパスツールピペットなどを利用してバンドを切り出し、DNAを溶出します。それをPCRに使い、その後シークエンシングを行います。バンドが十分に分離されていない場合は、TAクローニングなどの方法も考慮します。

変法について

DGGEのバリエーションとして、TGGE（温度勾配ゲル電気泳動法）やCDGE（一定濃度の変性剤を用いる方法）があります。TGGEでは変性剤ではなく温度勾配によってDNAを変性させ、CDGEでは勾配をつけない一定濃度の変性剤を使用して、既知の変異を簡便に判定する手法です。

DGGEを用いた手法は、DNAの解析において非常に実用的であり、特に微生物群集の研究においてその価値が高まっています。

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