制限点

制限点（R点）

制限点（restriction point; R点）は、細胞が細胞周期のG1期に設けている重要なチェックポイントです。この時点を境に、細胞は外界からの増殖を促すシグナルに依存することなく、次のDNA複製期（S期）へと進行することが不可逆的に決定されます。酵母においては「Start」とも呼ばれます。制限点はしばしばG1/S期チェックポイントと同一視されますが、両者が完全に同じものか、あるいは異なるポイントであるかについては現在も議論があります。制限点の通過は、G1期およびG1/S期におけるサイクリン-CDK複合体の活性化によって生化学的に特徴づけられます。これらの複合体は、DNA複製や中心体の複製など、細胞周期初期のイベントを開始させるタンパク質をリン酸化することで機能します。

歴史的背景

制限点の概念は、細胞周期研究の進展とともに明らかになりました。まず、ハワード・マーティン・テミンは、ニワトリの細胞がDNA複製に進む段階に達すると、外部からのシグナルなしで増殖を続けられることを発見しました。その後、1973年にアーサー・パーディーが、増殖因子への依存性がなくなる時点がG1期に一つだけ存在することを実験的に示しました。当時、G1期は単に分裂期（M期）とS期の間の期間として定義されており、その内部の特定の状態を示す指標はほとんどありませんでした。パーディーは、アミノ酸の除去や血清の除去といった異なる細胞周期阻害条件下で細胞を培養し、どの阻害要因もS期への進行を同じ効率で妨げることを観察しました。この結果から、これらの要因がG1期における共通の決定点に作用していると推測し、そのポイントを制限点（restriction point; R点）と名付けました。

さらに1985年、ZetterbergとLarssonは、血清の除去が細胞周期の全ての段階でタンパク質合成を阻害することを発見しましたが、特に有糸分裂直後のG1期初期の細胞だけが血清除去によって静止期（G0期）に移行することを確認しました。またZetterbergは、細胞周期の長さの変動の大部分が、R点からS期に入るまでの時間のばらつきに起因することを見出しました。これらの研究は、R点が細胞増殖の制御における主要な決定点であることを強く示唆しました。

細胞外シグナルとの関連

初期胚発生時を除き、多くの多細胞生物の細胞は増殖しない静止状態（G0期）にあります。成体の組織では、特定の種類の細胞のみが増殖を続けます。どちらの場合でも、細胞はG0期にとどまるか、再びG1期に入って増殖を開始するかという重要な選択を行います。この決定は、S期よりも前のG1期に位置する制限点で行われます。

細胞はR点に到達するまで、細胞外からの増殖促進因子や抑制因子のシグナルを受け取り、それに応じて応答します。G1期の初期段階（competence、G1a、G1bなどと呼ばれる）では、これらの外部刺激因子が細胞周期の進行に不可欠です。しかし、G1b期後半にあるR点を通過すると、細胞外からのシグナルはもはや必要なくなり、細胞は内部のメカニズムによって自律的にDNA複製とその後の細胞分裂へと進みます。もし細胞がR点に到達する前に増殖刺激因子が取り除かれると、細胞はG0期に戻ることがあります。再度刺激因子が供給され、細胞周期に復帰してR点を通過しS期に入るまでには、約8時間の準備期間が必要となります。

分裂促進シグナル伝達経路

PDGF、FGF、EGFといった成長因子は、細胞周期への移行とR点への進行を調節する主要な因子です。これらの成長因子からのシグナルは、細胞表面の受容体に結合することから始まります。R点を通過した後は、細胞周期の完了は外部からの分裂促進因子の存在に依存しなくなります。持続的な分裂促進因子のシグナルは、主にG1期サイクリンであるサイクリンDとCDK4/6複合体の形成と活性化を促すことで細胞周期への移行を推進します。この作用は、MAPK経路とPI3K経路という二つの主要なシグナル伝達経路を介して行われると考えられています。

MAPKシグナル伝達カスケード

成長因子がその受容体（RTK）に結合すると、受容体が二量体化し、細胞内のチロシン残基が自己リン酸化されます。リン酸化された部位にはSH2ドメインを持つGrb2のようなタンパク質が結合し、これがアダプターとしてSosのような他のシグナル伝達分子を細胞膜にリクルートします。SosはRasという小さなGTP結合タンパク質を活性化型（Ras-GTP）に変換します。活性型RasはMAPキナーゼカスケードを活性化し、Raf→MEK→ERK（MAPK）とキナーゼが順番にリン酸化されて活性化されていきます。

活性化されたERKは核内へ移行し、血清応答因子（SRF）などの転写因子を活性化します。これにより、FosやMycといった初期応答遺伝子の発現が誘導されます。FosはJunと二量体を形成して転写因子複合体AP-1となり、サイクリンD1などの遅延応答遺伝子の発現を活性化します。Mycもまた、サイクリンD2やCDK4の誘導に関与するなど、細胞の増殖や成長を促進する様々な遺伝子の発現を調節します。ERKの持続的な活性化はCDK2の活性化や核局在にも寄与し、R点通過をさらに促進します。

PI3K経路によるシグナル伝達

活性化されたRTKには、別のSH2ドメインを持つp85というタンパク質も結合し、PI3Kをリクルートします。PI3Kは脂質PIP2をPIP3に変換し、Aktを細胞膜に呼び寄せます。Aktは活性化されると、細胞の増殖や生存を促進する機能に加えて、細胞周期の進行を調節します。例えば、GSK3βを阻害することでサイクリンD1の分解を防ぎ、mTORを活性化することでサイクリンD1の翻訳を促進します。また、CDK阻害因子（CKI）であるp27やp21をリン酸化し、それぞれの不安定化や核外移行を促進することで、これらの阻害因子の作用を弱めます。さらに、p27の発現を調節するFOXO4転写因子をリン酸化して不活性化します。これらのAktの働きは、サイクリンD1を安定化させ、CKIの作用を抑制することにより、G1期およびG1/S期のサイクリン-CDK複合体の活性を高め、R点通過を助けます。

抗増殖シグナル伝達

サイトカインであるTGF-βのような抗増殖因子は、分裂促進シグナルとは反対に、R点の通過を妨害し、細胞をG1期で停止させます。TGF-βからのシグナルはSmadというタンパク質を活性化します。活性化されたSmadはE2F4/5と複合体を形成してMycの発現を抑制したり、Miz1と結合してCKIであるp15INK4bの発現を促進したりします。p15INK4bはサイクリンD/CDK複合体の形成や活性を直接阻害します。TGF-βによって細胞周期が停止した細胞では、p27やp21といった他のCKIも蓄積することが知られています。

制限点通過のメカニズム

全体として、細胞外の成長因子からのシグナルは、受容体への結合、様々なリン酸化カスケードを経て細胞内シグナルを伝達します。これらのシグナルによって、特定の標的遺伝子の転写が活性化され、細胞周期を駆動するタンパク質が合成されます。特にサイクリンDの蓄積がR点通過に不可欠です。

細胞周期の進行は、主にサイクリンとCDKの複合体によって制御されています。サイクリンDは、CDK4またはCDK6と結合し、さらにCDK活性化キナーゼ（CAK）によってリン酸化されることで活性化されます。この活性型サイクリンD/CDK複合体が細胞をR点へと導きます。サイクリンDは非常に不安定であり、半減期が短いため、その量は分裂促進シグナルのレベルにきわめて敏感に反応します。分裂促進シグナルはサイクリンDの産生を促すだけでなく、その安定化も助けるため、サイクリンDは文字通り分裂促進シグナルの「センサー」として機能します。一方、INK4ファミリーやp21、p27などのCKIは、不適切なサイクリン/CDK活性を抑制することで、R点制御の厳密性を保証します。

活性型サイクリンD/CDK複合体は、核内でRbタンパク質（pRb）をリン酸化します。リン酸化されていないpRbは、転写因子E2Fに結合してその活性を抑制し、G1期の進行を阻止するブレーキとして働きます。サイクリンD/CDKによるpRbのリン酸化が一定レベルに達すると、E2FはpRbから遊離し、活性化されます。遊離したE2FはサイクリンEやサイクリンAといったG1/S期やS期に必要な遺伝子の転写を活性化します。その結果、活性型サイクリンE/CDK複合体が蓄積し始め、これがさらにpRbを強くリン酸化することで、完全にE2Fを解放し、不可逆的にS期への移行を決定づけます。

CDK阻害因子（CKI）とサイクリンD/CDK複合体活性の調節

p27とp21は、G1/S期およびS期サイクリン/CDK複合体を直接阻害するCKIです。p21のレベルは細胞周期への移行時に上昇する一方、p27は通常、G1期が進むにつれて不活性化されます。細胞が高密度になったり、分裂促進因子が不足したり、TGF-βが存在したりすると、p27が蓄積して細胞周期が停止します。DNA損傷などのストレスはp21のレベルを増加させますが、分裂促進因子によるERK2やAktの活性化は、p21をリン酸化して不活性化させます。

初期の研究ではp27がサイクリンD-CDK4/6複合体とサイクリンE/A-CDK2複合体の両方を阻害すると考えられていました。しかしその後の研究、特に速度論的研究や遺伝子ノックアウトマウスを用いた研究から、p27やp21はサイクリンD-CDK4/6複合体の場合、むしろその組み立てや活性化を促進する側面を持つことが示唆されています。これらのCKIがサイクリンD-CDK4/6複合体に結合した状態で、チロシン残基のリン酸化などによって阻害型と非阻害型の状態が切り替わるというモデルも提唱されています。また、p27がサイクリンD-CDK4/6に結合することで、サイクリンE-CDK2を阻害するために利用できるp27の量が減少し、結果的にサイクリンE-CDK2の活性化を助ける可能性も考えられています。G1期終盤からS期にかけてサイクリンE/CDK2やサイクリンA/CDK2の活性が高まると、p21やp27がリン酸化され、核外へ輸送されたり、ユビキチン化されて分解されたりすることで、これらのCKIの阻害作用が解除され、細胞周期はさらに進行します。

制限点のダイナミクス

R点には、E2Fによって駆動されるヒステリシス（履歴依存性）を持つ双安定スイッチが存在することが示されています。E2Fは自身の活性化を促すとともに、自身の阻害因子であるpRbの不活性化（リン酸化）も促進するという、ポジティブフィードバックループを形成します。このようなフィードバックループは、細胞の状態が「G1期にとどまる（オフ）」か「S期に進む（オン）」かの二つの安定した状態をとりやすくし、一度S期へ向かう決定がなされると簡単には元に戻らないという、不可逆的なスイッチング機構をもたらします。血清濃度を変えて一細胞レベルでE2F活性を観察した実験では、E2Fの活性が完全にオンかオフのいずれかの状態をとることが確認されており、この双安定スイッチの存在を裏付けています。

がんとの関連

R点の正常な機能が破綻すると、細胞は増殖を制御するブレーキを失い、継続的に不適切な細胞周期への進行が起こり、がんが発生する可能性があります。R点通過を制御する経路に関わる多くの遺伝子に変異が生じることが、細胞のがん化を引き起こす原因となります。がんで頻繁に変異が見られる遺伝子には、CDKやCKIをコードするものが含まれます。CDKの過剰な活性化やCKIの機能低下は、R点の厳密な制御を損ない、細胞が本来ならばG0期へ移行すべき状況でも老化を回避して増殖を続けてしまうことにつながります。

R点は、新たながん治療薬の開発においても重要な標的となっています。正常な細胞の増殖はR点によって厳密に制御されていますが、がん細胞ではこの制御がしばしば破綻しています。化学療法薬は通常、急速に分裂している細胞を攻撃するため、正常な細胞も影響を受けやすいという問題があります。成長因子受容体阻害剤など、R点通過を阻害する薬剤を用いることで、正常細胞の増殖を一時的に停止させ、化学療法から保護するというアプローチが研究されています。これにより、化学療法の副作用を軽減しつつ、がん細胞を選択的に攻撃することが期待されています。

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