蛍光共鳴エネルギー移動

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）

蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer、略称：FRET）は、分子間でのエネルギーの受け渡し現象の一つです。これは、近距離に存在する二つの分子、特に蛍光性を持つ分子や発色団の間で起こります。ドイツの科学者テオドール・フェルスターによってその理論が定式化されたことから、フェルスター共鳴エネルギー移動とも呼ばれます。

仕組み

FRETは、一方の分子（エネルギー供与体、ドナー）が光などのエネルギーを受け取って励起状態になった際、その励起エネルギーを、近くにあるもう一方の分子（エネルギー受容体、アクセプター）に非放射的に受け渡す現象です。これは、ドナー分子の励起状態から基底状態への遷移に伴う電気的な振動（遷移双極子）と、アクセプター分子の基底状態から励起状態への遷移に伴う電気的な振動が共鳴することで起こります。エネルギーを受け取ったアクセプターが蛍光分子であれば、このアクセプターがエネルギーを放出する際に蛍光を発します。

このエネルギー移動が効率的に起こるためには、ドナー分子が放出する光の波長域（発光スペクトル）と、アクセプター分子が吸収する光の波長域（吸収スペクトル）にある程度の重なりが必要です。つまり、ドナーが持っているエネルギーをアクセプターが受け取れる波長である必要があります。また、アクセプターは光を吸収する能力（モル吸光係数）が高いほど、FRETは起こりやすくなります。この点は、電子交換によってエネルギーが移動するデクスター機構とは異なる性質です。デクスター機構はアクセプターのモル吸光係数に依存しませんが、FRETもデクスター機構も、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりが大きいほどエネルギー移動が起こりやすいという共通点があります。

距離依存性

FRETの最も重要な特徴の一つは、そのエネルギー移動効率が分子間の距離に極めて強く依存することです。具体的には、効率は距離の「6乗」に反比例します。これは、距離がわずかに離れるだけで効率が劇的に低下することを意味します。このため、FRETは一般的に1ナノメートルから10ナノメートル程度の非常に短い距離でしか有効に働きません。デクスター機構も距離に依存しますが、こちらは距離の指数関数に依存し、有効範囲はさらに短い1ナノメートルから2ナノメートル程度です。この距離依存性の違いから、FRETは比較的希薄な環境でも機能しやすいのに対し、デクスター機構はより密接な接触が必要となります。

FRET効率が50%になるドナーとアクセプター間の距離は「フェルスター距離（R₀）」と呼ばれ、その値はドナーの蛍光特性（量子収率）、アクセプターの吸収特性（モル吸光係数）、両分子の電気的な向き（双極子配向因子）、および周囲の媒質の性質（屈折率）によって決まります。理論的にはこれらの因子からR₀を計算し、実際のFRET効率から分子間距離を推定することが可能です。

測定方法と課題

FRETが発生しているかどうかを評価するにはいくつかの方法があります。一般的なのは、ドナーだけを励起する波長の光を当て、アクセプターから発せられる蛍光の強度がどのように変化するかを観測する方法です。FRETが起こるとアクセプターの蛍光が増加します。また、ドナー分子自身の蛍光に着目する方法もあります。FRETによってエネルギーがアクセプターに移動するため、ドナーの蛍光は弱くなったり、ドナーが励起状態から基底状態に戻るまでの時間（蛍光寿命）が短くなったりします。これらの変化を測定することで、FRETの発生やその効率を知ることができます。

FRET効率から分子間の距離を計算することも試みられますが、これには課題も伴います。FRET効率は分子間の距離だけでなく、ドナーとアクセプターの分子がどのような向きを向いているか（双極子配向）にも影響されます。もし分子の向きが時間とともにランダムに変化する場合は、平均的な向きを仮定して距離を推定できますが、例えばタンパク質に固定された蛍光分子のように、分子の向きがあまり変化しない場合や特定の向きをとりやすい場合は、距離を正確に計算することが難しくなることがあります。しかし、相対的な距離の変化や、分子の配置に関する情報を得る上では非常に有用です。

応用

FRETは幅広い分野で活用されています。化学分野では、分子を設計する際に、特定の構造や反応が起こったときにFRETが生じるようにすることで、そのプロセスを検出するセンサーとして利用されることがあります。例えば、特定の物質が存在すると二つの分子が近づき、FRETが観測されるような試薬が開発されています。

特に分子生物学や生物物理学の分野でFRETは強力なツールとなっています。細胞内で特定の二種類のタンパク質が互いに結合するかどうか、またその結合がどのように変化するかを調べるのに広く用いられます。これを行うために、調べたい二つのタンパク質にそれぞれ異なる色の蛍光タンパク質（例えば、シアン色のCFPと黄色のYFPなど）をタグとして付けます。もし二つのタンパク質が細胞内で結合して近くに来ると、CFP（ドナー）からYFP（アクセプター）へのFRETが起こり、その結果としてYFPからの蛍光が増加したり、CFPの蛍光が減少したりするのを観測できます。これにより、生きた細胞内でのタンパク質間相互作用をリアルタイムで追跡することが可能になります。また、DNAの増幅をリアルタイムで検出するリアルタイムPCR技術の一部にもFRETが応用されています。

ただし、生物サンプルでは、測定対象以外の物質からの蛍光（自家蛍光）や、蛍光分子が光によって壊れてしまう褪色といった問題がFRETの観測を妨げることがあります。これらの問題を回避するために、光励起ではなく化学反応による発光を利用した、類似のエネルギー移動現象である生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）という技術も開発され、利用されています。

このように、FRETは分子間の近接情報を得るための重要な技術として、基礎研究から応用まで広く利用されています。

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