Cre-loxP部位特異的組換え

Cre-loxP部位特異的組換えシステム

Cre-loxPシステムは、特定のDNA配列間で高精度な遺伝子組み換えを行う技術です。このシステムは、1981年にバクテリオファージP1の研究から発見された部位特異的な組換え反応に由来します。バクテリオファージP1が宿主である大腸菌内で増殖する際、自身のゲノムを環状化し複製するために、この組換え機構を利用しています。その後、1987年にデュポン社の研究者ブライアン・サウアーによって真核生物での応用手法が開発されたことを契機に、現在では遺伝子の機能解析や病態モデル作成において、とくに「条件的遺伝子ノックアウト」を実現するための強力なツールとして世界中の研究で活用されています。

原理

Cre-loxP組換えシステムは、非常にシンプルながら高効率な反応系です。この反応に必要な主要な構成要素は、DNA組換え酵素であるCreタンパク質と、その標的となるDNA配列であるloxPのみです。

組換え酵素Cre

Cre（causes recombinationの略称）タンパク質は、loxP配列を特異的に認識してDNA分子間の組換えを触媒する酵素です。343個のアミノ酸から構成され、分子量はおよそ38キロダルトン（kDa）です。この酵素は、チロシンリコンビナーゼファミリーに属しており、その構造はバクテリオファージラムダのインテグラーゼと類似しています。

反応機構は、Creタンパク質の働きによって進行します。まず、Creの単量体が2つ、標的であるloxP配列の両端にある13塩基対（bp）の繰り返し配列をそれぞれ認識・結合します。これが2組集まることで、組換え反応を行うための複合体が形成されます。その後、Creタンパク質の324番目のチロシン残基がloxP配列内の特定の箇所を切断し、DNA鎖の交換を触媒します。この鎖交換を経て形成されるホリデイ・ジャンクション中間体が異性化し、再度同様の鎖交換反応が繰り返されることで、最終的にloxP配列間の組換えが完了します。

標的配列loxP

loxP（locus of crossing over in P1 phageに由来）は、バクテリオファージP1のゲノム内に本来存在する、34塩基対の短いDNA配列です。この配列は特徴的な構造をしており、中央の8塩基対は非対称ですが、その両側にある13塩基対は逆向き反復配列（パリンドローム）となっています。Cre酵素はこの構造を特異的に認識して結合します。

応用技術

Cre-loxPシステムは、研究対象生物のゲノム操作を革新的に容易にしました。この技術を用いることで、特定の遺伝子の発現を精密に制御したり、特定のDNA配列を効率的に除去したり、さらには染色体構造を意図的に改変したりすることが可能になりました。

Cre酵素は一般的に高等生物の細胞に内在しないため、このシステムを利用するためには、遺伝子改変技術を用いて利用したい細胞や組織でCreタンパク質が生産されるように操作する必要があります。同様に、loxP配列も34塩基対という比較的長い配列であるため、通常の生物のゲノムにはほとんど存在しないと考えられます。したがって、研究者が意図的にゲノム上の特定の場所にloxP配列を導入すれば、Cre酵素が存在する条件下でのみ、その導入したloxP部位間で組換えが起こり、それ以外の場所で非特異的な組換えが発生する可能性は非常に低いという高い特異性を持ちます。

一つのDNA分子上に二つのloxP配列が存在する場合、それらの配列の向きによって組換えの結果が変わります。もし二つのloxP配列が逆向きに配置されていれば、それらに挟まれたDNA領域は反転します。一方、二つのloxP配列が同じ向きに配置されていれば、挟まれたDNA領域はDNA分子から切り出されて除去されます。この原理を応用することで、ゲノム上の一部の配列を欠失させたり、反転させたり、あるいは染色体間でDNAを転位させたりするといった、多様なゲノム編集が可能になります。

条件的ノックアウト

このシステムの最も重要な応用の一つが「条件的遺伝子ノックアウト」です。発生段階で生命維持に必須な遺伝子は、従来の全身性ノックアウト手法では個体が発生しないため解析が困難でした。Cre-loxPシステムを用いることで、特定の細胞種、組織、あるいは特定の発生時期など、限定された条件下でのみ目的遺伝子を機能させなくする（ノックアウトする）ことが可能になりました。

具体的には、まず目的遺伝子の重要な部分をloxP配列で挟んだ（Floxedと呼びます）動物（例えばマウス）を作製します。次に、Cre遺伝子を、研究したい特定の組織や時期でのみ活性化する性質を持つプロモーターの制御下につなぎ込んだ動物を作製します。例えば、脳だけで遺伝子をノックアウトしたい場合は、脳で特異的に働くプロモーターを使ってCreを発現させるようにします。この二種類の動物を交配させ、両方の遺伝子（Floxed遺伝子とCre遺伝子）を受け継いだ子孫を選択します。この子孫の特定の組織（この例では脳）でCreタンパク質が生産されると、その細胞内のFloxed遺伝子はloxP配列間で組換えを起こして除去され、結果としてその組織だけで遺伝子の機能が失われた状態が実現します。

使用するプロモーターが、意図しない発生段階（例：胚発生初期）でも活性化してしまうという問題に対しては、Creタンパク質の活性を外部から制御する手法が開発されています。例えば、Creタンパク質を薬剤応答性（例えばドキシサイクリンやタモキシフェン）に改変することで、特定の薬剤を投与した時だけCreが核内に移行して組換えを触媒するように制御することが可能になり、ノックアウトのタイミングをより精密に制御できるようになりました。

条件的遺伝子修復

loxP配列の向きを調整することで、遺伝子を除去するのではなく、機能を停止させるための逆位を起こさせ、必要に応じて再度組換えを起こさせて逆位を解除し、遺伝子機能を回復させるという応用も可能です。これは特定の条件下で遺伝子機能をON/OFFするモデルの構築に利用されます。

選択マーカーの除去

遺伝子改変を行う際に、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を導入することが一般的ですが、これらのマーカーがその後の実験結果に影響を与える可能性が指摘されています。Cre-loxPシステムを用いることで、この問題を解決できます。まず、選択マーカー遺伝子の両側にloxP配列を配置して目的の遺伝子改変を行います。目的の改変が導入された個体を得た後、Cre遺伝子を発現させることで、loxP配列に挟まれた選択マーカー遺伝子のみを効率的に除去することが可能になります。

Cre-loxPシステムは、その特異性と汎用性の高さから、基礎生命科学研究から疾患モデル開発まで、幅広い分野で遺伝子機能解析の基盤技術として確立されており、様々な生命現象の解明に貢献しています。

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