ツーハイブリッド法

ツーハイブリッド法 (two-hybrid法)

ツーハイブリッド法は、生きた細胞内で特定のタンパク質同士、あるいはタンパク質とDNAの間に物理的な結合（相互作用）があるかどうかを検出するための、分子生物学的な手法です。

この手法の原形は、出芽酵母を用いたY2H (yeast two-hybrid) システムとして初めて確立されました。その後、酵母以外の生物種（例: 大腸菌）や、異なる転写活性化因子を用いた多様な改変法が開発されており、広範な研究に応用されています。

原理

ツーハイブリッド法の基本的な原理は、特定の遺伝子の転写を活性化する因子が持つ、DNAに結合する機能と転写を促進する機能が、それぞれ独立したドメインに存在し、これらを空間的に近接させることで機能が発揮されるという性質に基づいています。最も一般的なシステムであるY2Hでは、酵母の転写活性化因子であるGAL4タンパク質のこの性質を利用します。

GAL4タンパク質は、特定のDNA配列であるUASG (Upstream Activating Sequences for galactose) に結合するDNA結合ドメイン (DBD)と、他の転写因子複合体を呼び込み、転写を促進する転写活性化ドメイン (AD)を持っています。これらのドメインは通常は一つのタンパク質内にありますが、それぞれを切り離しても機能を発揮するポテンシャルを持っています。

ツーハイブリッド法では、調べたい二つのタンパク質、仮にタンパク質Aとタンパク質Bとします。まず、タンパク質AをGAL4のDNA結合ドメイン(DBD)に融合させた「DBD-A融合タンパク質」と、タンパク質BをGAL4の転写活性化ドメイン(AD)に融合させた「AD-B融合タンパク質」を、同じ酵母細胞内で同時に発現させます。釣りになぞらえて、DBD-A融合タンパク質は「ベイト (bait)」、AD-B融合タンパク質は「プレイ (prey)」と呼ばれることもあります。

この細胞には、UASG配列を上流に持つレポーター遺伝子（例: 酵母が特定の栄養を合成できる遺伝子や、発色反応を起こす酵素の遺伝子）があらかじめ導入されています。

もしタンパク質Aとタンパク質Bが細胞内で相互作用しない場合、DBD-A融合タンパク質はUASGに結合しますが、AD-B融合タンパク質とは物理的に離れたままです。そのため、レポーター遺伝子の転写は活性化されません。

しかし、もしタンパク質Aとタンパク質Bが細胞内で相互作用する場合、両者が結合することで、それに融合しているGAL4のDBDとADが物理的に近接します。これにより、UASGに結合したDBDの近くにADが引き寄せられ、転写活性化ドメインとしての機能が働き、レポーター遺伝子の転写が促進されます。レポーター遺伝子の発現が検出されれば、タンパク質Aとタンパク質Bの間に相互作用があったと判断できます。また、その発現レベルを測定することで、相互作用の強度をある程度評価することも可能です。

この手法を用いることで、単に相互作用の有無を調べるだけでなく、相互作用に関わるタンパク質の特定の領域（ドメイン）を絞り込んだり、相互作用に必須な特定のアミノ酸残基を同定したりする研究も行われています。

特徴と応用

ツーハイブリッド法は、試験管内（in vitro）での精製タンパク質を用いた相互作用解析とは異なり、生きた細胞内というより生理的な環境でタンパク質の相互作用を検出できるという利点があります。細胞内で適切なフォールディングや翻訳後修飾を受けた状態での相互作用を評価できる可能性があるためです。

一方で、非特異的な結合による擬陽性（偽の陽性結果）が多いという欠点も指摘されています。そのため、ツーハイブリッド法で得られた相互作用候補は、免疫沈降法やプルダウンアッセイ、あるいは蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) といった、他の独立した手法を用いて検証することが非常に重要です。

この手法の最大の強みの一つは、多数のサンプルを一度に解析できるハイスループット性です。このため、特に未知のタンパク質間相互作用の相手を網羅的に探索するスクリーニングに広く活用されています。

スクリーニングでは、例えば特定のターゲットタンパク質（ベイト）に対して、細胞や組織から調製したcDNAライブラリーをプレイとして用いることで、そのターゲットタンパク質と相互作用する可能性のある未知のタンパク質を効率的に多数同定することが可能です。

さらに規模を拡大して、ある生物種に含まれる特定の機能を持つタンパク質のグループ、あるいはその生物が持つ全てのタンパク質を対象として、網羅的なタンパク質間相互作用のネットワーク全体（インタラクトーム）を明らかにするための大規模なプロジェクトにも用いられています。このような取り組みは、ヒトゲノム計画に続くポストゲノム時代（20世紀末から21世紀初頭）における、タンパク質の網羅的解析であるプロテオーム解析の中心的な研究分野の一つとして大いに発展しました。

関連手法

免疫沈降法
プルダウンアッセイ
ワンハイブリッド法 (タンパク質とDNAの相互作用検出)
蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)
* ファージディスプレイ

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