ペプチドマスフィンガープリンティング

ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）

ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）は、1993年に複数の研究グループによって独立に開発された、タンパク質の同定に用いる革新的な技術です。この手法は、未知のタンパク質を小さなペプチド断片に分解し、それらの質量を計測することで行われます。質量分析法としては、MALDI-TOFやESI-TOFが一般的に用いられます。

アプローチの基本

PMFでは、まず未知のタンパク質を分解して得られたペプチド断片の質量を計測します。そして、この質量データを計算機により既知のタンパク質データベースと照合します。この際、データベース内の塩基配列情報はアミノ酸配列に翻訳され、さらに論理的に断片化されて質量が計算されます。最終的には、質量分析装置から得られた実測データと、データベース内で算出された質量を比較し、最も信ぴょう性の高い一致を見つけ出します。

PMFの大きな利点は、エドマン分解のような時間を要する手法を必要とせず、迅速に同定が可能な点です。しかし、必要な条件として、検索するタンパク質がデータベースに存在しなければならないという制約があります。また、多くのPMF用のプログラムは、単一の未知タンパク質を前提としているため、複数のタンパク質が混合している場合には、適切に同定できないことがあります。このため、PMFを用いた同定では、タンパク質を事前に単離することが一般的です。複数のタンパク質が混在している場合には、MS/MSといったより高い識別能力を持つ技術を使用する必要があります。

分析プロセス

試料調製

PMFのプロセスは、まず分析対象タンパク質を電気泳動などで分離することから始まります。この過程で、タンパク質は化学的な修飾が施されます。例えば、システイン残基によるジスルフィド結合は分析において障害となるため、これを取り除くための還元やアルキル化処理が実施されます。次に、トリプシンやV8プロテアーゼなどの消化酵素を使い、タンパク質を小さなペプチド断片に分解します。典型的な酵素と基質の比率は50:1であり、これを一晩混合して処理します。得られたペプチドはアセトニトリルで抽出し、その後減圧乾燥され、最終的に少量の蒸留水に溶かして質量分析用試料とします。

質量分析

試料が調製されたら、MALDI-TOFやESI-TOFなどの質量分析装置でその質量を分析します。MALDI-TOFは特にスループットが高く、よく使用される機器です。MALDI-TOFにおいては、タンパク質断片をマトリックスと混合し、サンプルプレートにスポットして分析を行います。ここでは、マトリックスがペプチド断片を効率的に疎外化する役割を果たします。

分析が始まると、レーザーによってマトリックスが励起され、ペプチド断片が気化し、電場により加速されます。そこから質量分離部を通過し、検出器で計測されることによって各ペプチド断片の質量電荷比が明らかになります。

コンピュータによる解析

最終的に得られるデータは、質量電荷比の一覧であるピークリストです。このデータを基に、Swiss-ProtやGenBankなどのデータベース内の配列情報と照合します。専用のソフトウェアは、データベース内のタンパク質を論理的に切断し、質量を計算後、実測データとの比較を行います。その結果、最も一致する可能性のあるタンパク質が特定され、一覧表示される仕組みになっています。

このような方法によって、ペプチドマスフィンガープリンティングはタンパク質の同定を迅速かつ効率的に行う手法となっています。

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