カエル卵抽出液

カエル卵抽出液（かえるらんちゅうしゅつえき）

カエル卵抽出液（frog egg extract）は、カエルの卵を遠心分離して得られる細胞成分を含む液体です。これは細胞生物学の研究において、細胞が生体内で示す様々な機能、特に細胞分裂のサイクル（細胞周期）の進行や、遺伝情報を持つゲノムDNAがどのように複製され、娘細胞に分配されるかの分子レベルでの仕組みを、生きた細胞を用いずに試験管内で再現し、解析するための優れた無細胞実験系として利用されています。

歴史的背景

カエル卵を用いた抽出液研究の始まりは、1983年に増井禎夫氏がヒョウガエル（Rana pipiens）の未受精卵からこの無細胞系を開発し、その可能性を示した報告に遡ります。その後、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵を用いた同様の実験系が確立され、これが細胞周期研究の飛躍的な発展を支える重要なツールへと成長しました。今日、「卵抽出液」と言えば、ほとんどの場合がXenopus laevisの卵から調製されたものを指しますが、ニホンヒキガエル（Bufo japonicus）やネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis）といった他のカエル種由来の抽出液も研究に用いられています。

抽出液の調製基礎と種類

カエルの未受精卵は、受精を待つ間、減数第二分裂の中期という特定の細胞周期段階で活動を停止しています。受精が起こると、卵内部の小胞体から放出されるカルシウムイオン（Ca$^{2+}$）の濃度が一時的に上昇し、これが引き金となって細胞周期の停止状態が解除されます。その結果、初期胚で観察される、DNA複製期（S期）と分裂期（M期）を交互に繰り返す急速な細胞分裂（卵割）のサイクルが開始されます。

M期抽出液

カエルの未受精卵を、Ca$^{2+}$捕捉剤であるEGTAを含む緩衝液と共に遠心管に入れ、軽く遠心して余分な液体を除いた後、比較的低速（約10,000g）で強く遠心して破砕することで、卵黄、可溶性成分、脂質の三つの層に分離できます。この中央に位置する透明な可溶性成分がM期抽出液です。この抽出液は、細胞を分裂期へと誘導する主要な因子であるMPF（M-phase promoting factor、サイクリンB-Cdk1複合体とほぼ同じもの）が高い活性を保っています。この抽出液に、界面活性剤で処理して原形質膜を取り除いた精子核由来のクロマチンを加えると、およそ1時間のインキュベーションでM期特有の凝縮した染色体が形成されます。さらに、その染色体の周囲に微小管が集まり始め、やがて二つの極を持つ紡錘体が組み立てられる様子も観察できます。

S期抽出液（間期抽出液）

M期抽出液に、抽出液中に残存するEGTAを上回る濃度の塩化カルシウム（CaCl$_{2}$）を添加すると、MPFが急速に不活性化されます（主にサイクリンBがプロテアソームによって分解されるため）。これにより、細胞周期は分裂後期を経てS期へと移行します。このようにして得られる抽出液をS期抽出液、あるいは間期抽出液と呼びます。S期抽出液に精子クロマチンを加えると、まず膨らんだクロマチンの周囲に膜状の小胞が集まり、それらが融合することで核膜が形成され、機能的な細胞核が再構成されます。さらに、形成された核と周囲の細胞質の間で物質の活発なやり取りが起こり、核内のゲノムDNAが効率良く複製されます。これらの卵抽出液には大量のmRNAとリボソームが含まれているため、タンパク質の合成（翻訳）も試験管内で進行します。このように、カエル卵抽出液を用いた無細胞系は、増殖期の細胞で起こる多くの重要な現象をin vitroで再現できます。ただし、実際の卵や初期胚における転写停止状態を反映して、この抽出液中では一般的に転写はほとんど起こらない点が特徴です。

研究用途に応じた多様な抽出液

特定の研究目的のために、基本的な卵抽出液に様々な改良が加えられた多様な無細胞系が開発されています。

サイクリング抽出液 (cycling extract): 未受精卵をCaイオノフォア処理や電気刺激などによって、受精時の細胞応答を人工的に引き起こしてから破砕することで得られます。この抽出液は自律的にS期とM期を数回繰り返す性質を持ち、細胞周期がどのように進行し制御されるか、特にサイクリンBタンパク質の合成と分解が分裂期への移行に不可欠であることが明らかになるなど、細胞周期進行メカニズムの解析に威力を発揮しました。
超遠心分画 (high-speed supernatant [HSS]): 通常の卵抽出液をさらに強力な超遠心分離（100,000～200,000g）にかけることで、膜成分やリボソームといった粒子状の構造物を取り除き、可溶性のタンパク質成分を濃縮した画分です。HSSは、細胞周期に伴うクロマチン構造の変化などを部分的に再現できますが、核の形成やタンパク質の翻訳は起こりません。主に、特定のタンパク質の生化学的機能や精製などに利用されます。
核質抽出液 (nucleoplasmic extract [NPE]): S期抽出液に多数の精子クロマチンを加えて人工的に核を形成させ、この反応液を希釈せずに遠心すると、核成分が上層に分離されます。この核だけを集めてさらに強く遠心することで、核膜やクロマチンなどの沈殿物から核の可溶性成分（核質）を分離した上澄みが得られ、これが核質抽出液です。核質抽出液とS期HSSを組み合わせた系では、DNAの周囲に核膜が形成される過程を経ずにDNA複製を誘導できる点が大きな利点です。これにより、複製開始に至る複雑なプロセスを詳細に調べることが可能になりました。また、精子由来でないDNA（例えばプラスミドDNA）を用いた場合でも、高い効率で複製を再現できるため、DNAに損傷を導入してその修復機構を研究する際にも有用です。