H2AX

H2AXとγH2AX

H2AXの概要

真核生物の細胞核では、DNAはヒストンと呼ばれる塩基性タンパク質に巻き付いてコンパクトに折り畳まれ、クロマチンと呼ばれる構造を形成しています。このクロマチン構造の基本単位はヌクレオソームであり、これはヒストン八量体（H2A、H2B、H3、H4の各々2分子からなる）にDNAが巻き付いたものです。H2AXは、このヒストンH2Aファミリーに属するバリアント（異種体）の一つであり、特定のH2AX遺伝子によってコードされています。哺乳類では、クロマチン中のH2A全体の約2%から25%を占めるとされています。H2AXは、単にクロマチン構造の構成要素であるだけでなく、ヌクレオソームの形成、クロマチン構造の動的な変化（クロマチンリモデリング）、そして特にDNAの損傷修復といった重要な cellular process に関与しています。さらに、in vitro（試験管内）の研究では、DNAの二本鎖切断（DSB）の有無を検出するためのアッセイにおいても利用されています。

γH2AXの形成とその意義

DNAに二本鎖切断(DSB)という深刻な損傷が生じると、細胞はこの危機に対応するための一連の応答機構を活性化します。γH2AXは、このDNA損傷応答において中心的な役割を果たす分子の一つです。これは、H2AXタンパク質の139番目のセリン残基がリン酸化された形態を指します。このリン酸化反応は、主にPI3K関連キナーゼファミリーに属する酵素、特にATM（Ataxia-telangiectasia mutated）や、ATR（ATM- and Rad3-related）、DNA-PKcs（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit）によって触媒されます。γH2AXの形成は、細胞が電離放射線に曝露されたり、DNA複製中に問題が発生して複製フォークが崩壊したりする場合に誘導されます。また、免疫系で抗体やT細胞受容体の多様性を生み出すためのV(D)J組換えのような、制御された生理的なプロセスにおいてもDSBが生じ、それに伴ってγH2AXが形成されます。γH2AXは細胞内のDSBの存在を示す非常に高感度な指標として広く認識されており、損傷部位を探索するための標的となります。しかし、γH2AXの存在が必ずしもDSBの直接的な証明となるわけではない点には注意が必要です。

DNA損傷応答における役割

DSBが生じた直後、損傷部位のクロマチン構造はダイナミックに変化します。これには、クロマチンに結合している一部のタンパク質の放出が関与します。例えば、ヒストンH3のリジン9番メチル化部位に結合するHP1β（CBX1）は、DSBが生じてからわずか1秒以内にかなりの量が放出されます。このHP1βの放出が、クロマチン構造の再編成を開始させ、ATMなどのキナーゼがH2AXにアクセスしやすくなることで、γH2AXの迅速な形成を促進すると考えられています。電離放射線照射後、γH2AXは早ければ20秒で検出され、1分後には最大量の半分に達します。γH2AXによる修飾はDSB部位から両側に約100万塩基対にも及ぶ広範囲のクロマチンに広がります。この広範囲に及ぶγH2AX修飾は、損傷部位に様々なDNA修復関連タンパク質を集積させるためのプラットフォームとして機能します。

損傷部位でのタンパク質リクルート

形成されたγH2AXは、最初にMDC1（Mediator of DNA damage checkpoint 1）というアダプタータンパク質と結合します。このγH2AX/MDC1複合体が、DSB修復プロセスに関わる他の多数のタンパク質を組織的にリクルートするための重要な足場となります。MDC1に結合したユビキチンリガーゼであるRNF8とRNF168は、損傷周辺のクロマチンを構成する他のヒストンやタンパク質をユビキチン化します。このユビキチン化シグナルを介して、BRCA1や53BP1といった主要なDNA修復タンパク質が、広くγH2AXによって修飾されたクロマチン領域に安定して集まってきます。他にも、DSB修復に不可欠なMRN複合体（MRE11、RAD50、NBS1）、相同組換えに関わるRAD51、そしてリン酸化酵素であるATM自身などもγH2AX修飾クロマチン上に集積します。RAD52やRAD54のような他のDNA修復因子は、これらのコア構成要素と迅速かつ可逆的に相互作用することで修復プロセスに関与すると考えられています。

クロマチンリモデリングへの関与

真核生物の細胞において、DNA上で起こる転写や複製、修復といったプロセスは、DNAが密にパッキングされたクロマチン構造によって物理的な障壁を受けます。これらのプロセスが効率的に行われるためには、必要に応じてクロマチン構造を一時的に変化させる「リモデリング」が必要です。γH2AXは、DSB発生後のクロマチン構造を緩める「脱凝縮」というプロセスに関与していることが示されています。γH2AXそのものが直接脱凝縮を引き起こすわけではありませんが、DSB応答においてリクルートされるRNF8が重要な役割を果たします。RNF8は、ヌクレオソームのリモデリングや脱アセチル化に関わるNuRD複合体の一部であるCHD4（Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4）と相互作用することが知られており、この連携を介して損傷部位周辺の広範囲なクロマチン脱凝縮を媒介すると考えられています。

アッセイとしての利用と注意点

γH2AXの検出は、細胞や組織中のDNAに生じた二本鎖切断の数を評価するための一般的な手法として確立されています。特に、電離放射線によって誘導されるDSBの数と、細胞核内に観察されるγH2AXの凝集した領域（foci）の数との間には、用量依存的な強い定量的相関があることが多くの研究で報告されています。これにより、γH2AX fociは電離放射線による細胞損傷の優れたバイオマーカーとして利用されています。しかし、γH2AXの形成は電離放射線以外の様々な細胞ストレス（化学物質、酸化ストレスなど）や、細胞周期の一部の段階でも起こり得ることが知られています。また、DSB部位だけでなく、損傷を受けていない領域のクロマチンでもγH2AXシグナルが検出されることがあります。これは、活性化されたATMなどのキナーゼが損傷部位から拡散し、遠方のH2AXをリン酸化するためと考えられています。したがって、γH2AXシグナルの解釈にあたっては、その形成を引き起こす様々な要因や、損傷部位からのシグナルの広がりを考慮する必要があります。なお、外部からの処理を行っていない正常な細胞においても、細胞呼吸に伴う内因性の酸化物質によるDNA損傷などにより、低レベルのγH2AXが恒常的に存在しており、これもDNA損傷の指標となり得ると考えられています。

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