N-結合型グリコシル化

N-結合型グリコシル化

N-結合型グリコシル化（N-linked glycosylation）は、タンパク質分子に対し、アミノ酸の一つであるアスパラギン（Asn）残基の側鎖にあるアミド基の窒素原子を介して、数個の糖分子が連なった炭水化物であるオリゴ糖（糖鎖やグリカンとも呼ばれる）が付加されるプロセスです。この化学修飾はN-グリコシル化とも称されます。

このタイプの糖鎖結合は、特に真核生物において、多くのタンパク質の立体構造形成や、その機能発現に不可欠な役割を果たしています。真核生物に加えて、古細菌でも普遍的に見られる修飾ですが、細菌では非常に稀です。タンパク質に付加されるN-結合型糖鎖の構造的な特徴は、修飾を受ける個々のタンパク質の種類や、そのタンパク質が生産される細胞の種類、さらには生物種によって大きく異なります。これは、それぞれの生物種が独自の糖鎖合成機構を持つためです。

結合のメカニズム

N-結合型糖タンパク質には、主に二種類の化学結合が関わっています。一つは糖鎖内部を構成する個々の糖残基同士を結びつける結合、もう一つは糖鎖全体とタンパク質本体を連結する結合です。

糖鎖内の糖は、通常、グリコシド結合によって繋がっています。この結合は、多くの場合、ある糖分子の1位の炭素ともう一方の糖分子の4位の炭素の間で形成されます。グリコシド結合の生成は、そのままではエネルギー的に起こりにくい反応であるため、エネルギーを供給する機構が必要です。細胞内では、通常、アデノシン三リン酸（ATP）の加水分解によって放出されるエネルギーと共役して進行します。

一方、糖鎖とタンパク質本体の連結には、アスパラギン側鎖のアミド窒素への結合が用いられます。N-結合型糖鎖は、ほとんどの場合、タンパク質のアミノ酸配列上に存在する特定の共通パターン（コンセンサス配列）内で、アスパラギン残基に付加されます。このコンセンサス配列は typically Asn-X-Ser または Asn-X-Thr で表され、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸です。動物細胞では、このアスパラギンに付加される最初の糖分子は、ほぼ例外なくβ結合したN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）です。このβ結合は、糖鎖内部のグリコシド結合とは異なり、糖分子のアノマー炭素がヒドロキシル基ではなく、アスパラギン側鎖のアミド窒素に結合します。この連結に必要なエネルギーは、糖分子に結合したリン酸基が切断される際に放出されるエネルギーから得られます。

生合成経路

N-結合型糖鎖の合成過程は、主に以下の三段階を経て進行します。

1. ドリコール結合型前駆体オリゴ糖の合成: まず、小胞体膜に存在するドリコールと呼ばれる脂質分子に、糖分子が段階的に付加されていきます。この初期段階は小胞体膜の細胞質側で開始され、その後、膜を通過して小胞体内腔側で進行します。最終的に、タンパク質へ転移される直前の前駆体オリゴ糖は、2個のN-アセチルグルコサミン、9個のマンノース、3個のグルコースから構成される特定の構造を持ちます。
2. タンパク質への前駆体オリゴ糖の転移: 小胞体内腔側で合成された前駆体オリゴ糖は、翻訳途中の新生ポリペプチド鎖に転移されます。この反応は、オリゴ糖とドリコールを繋ぐピロリン酸結合が切断される際のエネルギーを利用します。糖鎖がポリペプチドに転移されるためにはいくつかの条件が必要です。アスパラギン残基が前述のコンセンサス配列内に存在すること、タンパク質の立体構造上、そのアスパラギンが親水性の表面または小胞体の内腔側に露出していることなどが挙げられます。この転移反応は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素群によって触媒され、多くの場合はタンパク質の翻訳とほぼ同時に進行します。
3. オリゴ糖のプロセシング: タンパク質に転移された後の糖鎖は、小胞体とゴルジ体を経由しながら、さらに修飾を受けます。小胞体では、糖鎖の非還元末端にある特定の糖残基がグリコシダーゼという酵素によって除去される初期のトリミングが行われます。この過程は、タンパク質の適切なフォールディング（折りたたみ）を監視する品質管理機構の一部としても機能します。タンパク質が正しくフォールディングすると、糖鎖末端のグルコース残基が除去され、小胞体からの輸送が可能になります。一方、適切にフォールディングしていない場合はグルコースが残存し、小胞体から移動できません。ゴルジ体では、さらに多様なグリコシダーゼによる糖の除去や、グリコシルトランスフェラーゼによる新たな糖残基の付加が行われ、高マンノース型、複合型、混合型といった様々な種類のN-結合型糖鎖構造が形成されます。高マンノース型は多数のマンノースを含む構造、複合型はコア構造に加えてガラクトースやシアル酸などが付加される構造、混合型はその中間的な特徴を持つ構造です。

原核生物におけるグリコシル化

細菌や古細菌の一部にも、真核生物と類似したN-結合型グリコシル化経路が見つかっています。しかし、原核生物で合成される糖鎖構造は、真核生物の小胞体で作られる初期の前駆体構造に近いものが多く、真核生物のようにゴルジ体で広範な修飾を受けることは少ないと考えられています。

機能と意義

N-結合型糖鎖は、タンパク質自体の安定性や溶解度、正しい立体構造の形成など、内的な機能に寄与するだけでなく、細胞認識や細胞間の相互作用といった外的な機能にも深く関わっています。

特に免疫系においては重要であり、免疫細胞の表面にあるN-結合型糖鎖パターンは、細胞が特定の組織へ移動する際のホーミングに関与したり、抗体分子（免疫グロブリン）に付加される糖鎖は、免疫受容体への結合親和性や、その後の免疫応答の種類（エフェクター機能）を調節したりします。また、糖鎖構造は「自己」と「非自己」の識別にも関わる可能性が示唆されており、様々な自己免疫疾患の病態との関連も研究されています。

臨床的には、N-結合型グリコシル化の異常は、関節リウマチ、糖尿病、クローン病、がんなど、広範な疾患の発症や進行と関連があることが報告されています。この修飾に関わる遺伝子の変異が、特に神経系の疾患を含む様々な遺伝性疾患の原因となることも知られています。

治療用タンパク質における重要性

近年、医薬品として用いられるタンパク質の多くは、N-結合型糖タンパク質です。例えば、抗体医薬品の多くがこれに該当します。

治療用タンパク質を製造する際には、どの細胞を発現宿主として用いるかが重要になります。細菌や酵母を用いた生産系は、高効率かつ低コストという利点がありますが、大部分の原核生物は翻訳後修飾であるグリコシル化を行いません。また、酵母や一部の動物細胞は糖鎖を付加できますが、ヒト細胞とは異なる糖鎖パターンを持つことが多く、これが治療薬として投与された際に、患者の体内で免疫反応（免疫原性）を引き起こす原因となることがあります。例えば、出芽酵母は免疫原性の高い高マンノース型糖鎖を産生しがちです。CHO細胞などの非ヒト哺乳類細胞はヒトに近い複雑な糖鎖を付加できますが、それでもヒトにはない特定の糖（例: Neu5Gcやα-galエピトープ）が付加される可能性があり、アレルギー反応などを引き起こすリスクがあります。

これらの問題を解決するため、遺伝子工学的手法を用いて発現宿主細胞の糖鎖合成経路を改変し、ヒト型に近い、あるいは特定の望ましい糖鎖パターンを持つ治療用タンパク質を生産する試みが活発に行われています。これには、目的とする糖鎖構造を合成しない遺伝子をノックアウトしたり、ヒトの糖鎖合成酵素遺伝子を導入したりするなどのアプローチが含まれます。改変された酵母、昆虫細胞、植物、さらには特定の細菌などが、次世代の治療用糖タンパク質生産系として開発されています。

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