RAF1
c-Rafは、ヒトでは_RAF1_遺伝子にコードされるセリン/スレオニンキナーゼ酵素です。別称として、proto-oncogene c-RAFやRAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase、Raf-1などとも呼ばれます。細胞内の重要なシグナル伝達経路であるMAPK/ERK経路（ERK1/2経路）において、Rasタンパク質サブファミリーの下流に位置するMAPキナーゼキナーゼキナーゼ（MAP3K）として機能します。Rafキナーゼファミリーの一員であり、プロテインキナーゼのTKL（Tyrosine-kinase-like）グループに属します。
Rafキナーゼの最初の発見は1983年に遡り、マウスのレトロウイルス（3611-MSV）から単離されたv-Rafでした。このウイルス遺伝子は、齧歯類の線維芽細胞をがん細胞株へと形質転換させる能力を示したことから、virus-induced rapidly accelerated fibrosarcomaに由来するv-rafと名付けられました。その後、鳥類のレトロウイルスMH2からv-milという類似の形質転換遺伝子が発見され、これらの遺伝子がセリン/スレオニンキナーゼ活性を持つ酵素をコードしていることが明らかになりました。
v-Rafとv-Milの正常な細胞におけるホモログは、マウスやニワトリで速やかに同定され、cellularを意味するc-Rafと名付けられました。これらの細胞性Rafは、細胞の成長や分裂を調節する役割を担うことが判明しました。現在、c-Rafは、最初に詳細に解析されたMAPK経路であるERK1/2シグナル伝達経路の主要な構成要素として、キナーゼカスケードの開始を担うMAP3Kとして認識されています。また、細胞性のRaf遺伝子に変異が生じることで、MEK1/2やERK1/2の過剰な活性化を引き起こし、がん遺伝子となりうることが実験的に示されました。
脊椎動物のゲノムには複数のRaf遺伝子が存在することが明らかになり、c-Rafの発見に続いてA-RafとB-Rafという2つの関連キナーゼが報告されました。近年、ヒトの腫瘍においてB-Raf遺伝子に発がん性の「ドライバー」変異が多く見られることが分かり、B-Rafに研究の焦点が当てられています。これらの変異は、Raf酵素の制御を受けない高活性化を誘導します。診断・治療標的としてのRafキナーゼへの関心は再び高まっています。
ヒトのc-Rafをコードする_RAF1_遺伝子は第3染色体上に位置しています。少なくとも2種類のアイソフォームが存在しますが、大きな違いはありません。主要なアイソフォームのmRNAは17個のエクソンから構成され、648アミノ酸からなるプロテインキナーゼをコードします。
c-Rafは他の多くのMAP3Kと同様に、触媒活性を調節するための複数の機能ドメインを持つ多ドメインタンパク質です。N末端領域には、Ras結合ドメイン（RBD）とCキナーゼ相同ドメイン1（C1ドメイン）が隣接して存在します。RBDはユビキチン様フォールド構造を持ち、GTP結合状態のRasタンパク質と特異的に結合します。C1ドメインはシステインに富み、2つの亜鉛イオンで安定化されるジンクフィンガー構造です。プロテインキナーゼCのC1ドメインに類似しますが、ジアシルグリセロールではなく、セラミドやホスファチジン酸などの他の脂質と相互作用し、活性型Rasの認識も補助します。これらのドメインは物理的に相互作用し、キナーゼドメインの活性を負に調節する単一のユニットとして機能することが示唆されており、歴史的にCR1（Conserved Region 1）と呼ばれていました。キナーゼドメインはCR3、両者を繋ぐ部分はCR2（ヒンジ領域）と呼ばれています。
CR1とキナーゼドメインの間にある比較的長いヒンジ領域は、すべてのRafタンパク質に特有です。この領域はセリンに富みますが、関連Raf間での配列保存性は低く、構造を持たず非常に柔軟性が高いと考えられています。自己阻害ドメインと触媒ドメイン間の「ヒンジ」として機能し、分子内の大きなコンフォメーション変化を可能にすると推測されています。ヒンジ領域には、リン酸化されたSer259残基（ヒトc-Raf）を中心とする14-3-3タンパク質の認識モチーフが存在します。同様のモチーフはキナーゼドメインよりもC末端側（Ser621中心）にも存在します。
c-RafのC末端側半分はキナーゼドメインとして折りたたまれ、触媒活性を担います。このドメイン構造はc-RafとB-Rafで詳細に解明されており、他のRafキナーゼやKSR、MLKファミリーなどTKLグループの他のMAP3Kとも類似しています。TKLグループはチロシンキナーゼの特徴も一部持ちますが、基質リン酸化はセリン/スレオニン残基に限定されます。Rafキナーゼの最も重要な基質は、自身を除くとMEK1とMEK2であり、これらの活性はRafによるリン酸化に厳密に依存します。
ヒトが属する脊椎動物には、c-Rafの他にB-Raf、A-Rafという2つのRafキナーゼが存在し、大部分が共通のドメイン構成、構造、調節機構を持ちます。これらの遺伝子は、脊椎動物進化初期の遺伝子重複により単一の祖先型Raf遺伝子から生じたと考えられています。多くの他の動物はRafを1つだけ持ち、例えばショウジョウバエではPhlまたはDraf、線虫ではLin-45と呼ばれます。
多細胞動物にはまた、Rafと密接に関連するKSR（Kinase Suppressor of Ras）と呼ばれるキナーゼファミリーが存在します。哺乳類などの脊椎動物にはKSR1、KSR2の2つのパラログがあります。KSRのC末端キナーゼドメインはRafに酷似しますが、N末端調節領域は異なります。KSRもヒンジ領域やC1ドメイン（CA3）に類似する領域を持ちますが、Ras結合ドメインは欠如しています。代わりに、N末端にCA1、CA2という特有の調節領域を持ちます。CA1領域は2012年にCC-SAM（coiled-coil attached SAM）ドメイン構造であることが判明し、KSRの膜結合を補助すると考えられています。KSRもRafと同様にリン酸化依存的な14-3-3結合モチーフを持ちますが、ヒンジ領域にはさらにMAPK（ERK1/2）結合モチーフ（FxFP配列）が存在し、Rafキナーゼのフィードバック調節に関与します。KSRはRafと同じ経路に関わりますが、その内在キナーゼ活性は極めて弱く、MEKリン酸化への寄与は小さいです。KSRの主要な役割は、Rafのヘテロ二量体化を促進し、アロステリック機構によりRafの活性化を大きく高めることであると考えられています。
c-Rafの活性制御は非常に複雑で、ERK1/2経路の「ゲートキーパー」として、多数の阻害機構により制御され、通常は段階的な活性化を受けます。最も重要な調節は、N末端の自己阻害ブロック（CR1）とキナーゼドメイン間の物理的な相互作用です。この相互作用により触媒部位が閉鎖され、キナーゼ活性は停止します。この自己阻害は、Rafの自己阻害ドメインがRas（特にGTP結合型）のような競合するパートナーと結合したときに解除され、c-Rafはキナーゼ活性化に必要な「開いた」コンフォメーションに変化します。
14-3-3タンパク質も自己阻害に関与します。14-3-3は二量体を形成し、2つの結合部位でパートナーを一定の距離と配向に固定する「手錠」のように機能します。c-Rafの2つの14-3-3結合モチーフに14-3-3二量体が結合すると、c-Rafは自己阻害を促進し、自己阻害ドメインと触媒ドメインの乖離を許さないコンフォメーションに固定されます。この14-3-3による固定は、結合モチーフの特定のセリン残基（Ser259とSer621）のリン酸化によって制御されます。このリン酸化にはTAK1などが関与し、プロテインホスファターゼ1や2A複合体によって脱リン酸化されます。ただし、Rafが活性化されて二量体を形成した状態では、14-3-3は二量体間の橋渡しとして結合し、二量体の解離を防ぎ安定化に寄与するなど、必ずしも阻害的ではなく、他の結合様式も存在します。
二量体化もc-Raf活性調節の重要機構であり、特にRafの活性化ループのリン酸化に必要です。通常、「開いた」構造のキナーゼドメインを持つ分子が二量体を形成します。c-Rafのホモ二量体化や他の因子（KSRなど）とのヘテロ二量体化が起こります。
c-Rafが十分な活性を持ち、活性化状態が安定化されるためには、活性化ループのリン酸化が不可欠です。この役割を果たすのは、現在のところ主にRafファミリーキナーゼ自身（トランスリン酸化）ですが、PAK1などもキナーゼドメイン近傍の他の残基をリン酸化することが示唆されています。c-Rafの場合、活性化ループのトランスリン酸化にはc-Raf自身とKSR1の双方を含む二量体（あるいはより大きな複合体）が必要です。このリン酸化により、活性化ループは強固な構造をとり、脱リン酸化されるまでキナーゼドメインを完全活性化状態に固定します。リン酸化された活性化ループは自己阻害ドメインの存在に対しても非感受性となります。KSRは活性化ループにリン酸化を受ける残基を持たないため、この最終段階は起こりません。完全に活性化されたc-Rafは、自身の基質と結合・リン酸化します。主要な基質はMEK1とMEK2であり、これらがリン酸化されることで活性化され、下流のERK1/2を活性化します。活性化されたERKは核へ移行し、転写因子を活性化するなど、細胞周期、細胞移動、アポトーシス抑制、細胞分化に関わる遺伝子発現制御に重要な役割を果たします。
c-Raf遺伝子の機能獲得型変異は稀ですが、いくつかの重篤な症候群に関与しています。これらの変異の多くは、14-3-3結合モチーフのいずれかに単一のアミノ酸置換が生じたものです。c-Rafの変異は、先天性心疾患、低身長、その他の奇形を伴うヌーナン症候群の原因の一つと考えられています。また、関連疾患であるLEOPARD症候群と呼ばれる複雑な欠陥症候群の原因ともなります。
実験的にはc-Rafはがん遺伝子に変異する能力を示し、ヒトの少数腫瘍でも変異が見られますが、ヒトの発がんにおいて主要な役割を担っているのは、姉妹キナーゼであるB-Rafです。
ヒト腫瘍試料の約20%でB-Raf遺伝子に変異が見られます。これらの変異の圧倒的多数はV600Eというアミノ酸置換です。この変異を持つBRAF-V600Eは、活性化ループのリン酸化を模倣し、正常な活性化制御を迂回してキナーゼドメインを常に活性化状態に保ちます。BRAF-V600Eはホモ二量体化またはc-Rafとのヘテロ二量体化を通じてc-Rafも活性化できるため、結果としてERK1/2経路が恒常的に活性化され、無制御な細胞増殖を引き起こします。
RasやB-Rafの変異は腫瘍形成に重要であることから、特にBRAF-V600E変異を標的としたRaf阻害剤ががん治療薬として開発されてきました。ソラフェニブが最初に臨床応用された薬剤であり、腎細胞がんや悪性黒色腫など、それまで治療が困難であったがんに新たな治療選択肢をもたらしました。ベムラフェニブ、レゴラフェニブ、ダブラフェニブなど、他の分子も開発されています。
ATP競合型のB-Raf阻害剤は、K-Ras変異を伴うがんにおいて望ましくない影響（逆説的活性化）を引き起こす可能性があります。これらの薬剤はB-Raf変異が主要因の場合にはB-Raf活性を効果的に阻害しますが、非変異のRaf遺伝子を持つがん、特に上流のK-Rasに変異がある場合、B-Rafのホモ二量体化やc-Rafとのヘテロ二量体化を促進することで、c-Rafの活性を阻害するのではなくむしろ高めてしまうことがあります。この「逆説的」なc-Raf活性化を避けるため、B-Raf阻害剤による治療を開始する前に、患者のB-Raf変異をスクリーニングすることが必須となっています。
発見の歴史
Rafキナーゼの最初の発見は1983年に遡り、マウスのレトロウイルス（3611-MSV）から単離されたv-Rafでした。このウイルス遺伝子は、齧歯類の線維芽細胞をがん細胞株へと形質転換させる能力を示したことから、virus-induced rapidly accelerated fibrosarcomaに由来するv-rafと名付けられました。その後、鳥類のレトロウイルスMH2からv-milという類似の形質転換遺伝子が発見され、これらの遺伝子がセリン/スレオニンキナーゼ活性を持つ酵素をコードしていることが明らかになりました。
v-Rafとv-Milの正常な細胞におけるホモログは、マウスやニワトリで速やかに同定され、cellularを意味するc-Rafと名付けられました。これらの細胞性Rafは、細胞の成長や分裂を調節する役割を担うことが判明しました。現在、c-Rafは、最初に詳細に解析されたMAPK経路であるERK1/2シグナル伝達経路の主要な構成要素として、キナーゼカスケードの開始を担うMAP3Kとして認識されています。また、細胞性のRaf遺伝子に変異が生じることで、MEK1/2やERK1/2の過剰な活性化を引き起こし、がん遺伝子となりうることが実験的に示されました。
脊椎動物のゲノムには複数のRaf遺伝子が存在することが明らかになり、c-Rafの発見に続いてA-RafとB-Rafという2つの関連キナーゼが報告されました。近年、ヒトの腫瘍においてB-Raf遺伝子に発がん性の「ドライバー」変異が多く見られることが分かり、B-Rafに研究の焦点が当てられています。これらの変異は、Raf酵素の制御を受けない高活性化を誘導します。診断・治療標的としてのRafキナーゼへの関心は再び高まっています。
分子構造
ヒトのc-Rafをコードする_RAF1_遺伝子は第3染色体上に位置しています。少なくとも2種類のアイソフォームが存在しますが、大きな違いはありません。主要なアイソフォームのmRNAは17個のエクソンから構成され、648アミノ酸からなるプロテインキナーゼをコードします。
c-Rafは他の多くのMAP3Kと同様に、触媒活性を調節するための複数の機能ドメインを持つ多ドメインタンパク質です。N末端領域には、Ras結合ドメイン（RBD）とCキナーゼ相同ドメイン1（C1ドメイン）が隣接して存在します。RBDはユビキチン様フォールド構造を持ち、GTP結合状態のRasタンパク質と特異的に結合します。C1ドメインはシステインに富み、2つの亜鉛イオンで安定化されるジンクフィンガー構造です。プロテインキナーゼCのC1ドメインに類似しますが、ジアシルグリセロールではなく、セラミドやホスファチジン酸などの他の脂質と相互作用し、活性型Rasの認識も補助します。これらのドメインは物理的に相互作用し、キナーゼドメインの活性を負に調節する単一のユニットとして機能することが示唆されており、歴史的にCR1（Conserved Region 1）と呼ばれていました。キナーゼドメインはCR3、両者を繋ぐ部分はCR2（ヒンジ領域）と呼ばれています。
CR1とキナーゼドメインの間にある比較的長いヒンジ領域は、すべてのRafタンパク質に特有です。この領域はセリンに富みますが、関連Raf間での配列保存性は低く、構造を持たず非常に柔軟性が高いと考えられています。自己阻害ドメインと触媒ドメイン間の「ヒンジ」として機能し、分子内の大きなコンフォメーション変化を可能にすると推測されています。ヒンジ領域には、リン酸化されたSer259残基（ヒトc-Raf）を中心とする14-3-3タンパク質の認識モチーフが存在します。同様のモチーフはキナーゼドメインよりもC末端側（Ser621中心）にも存在します。
c-RafのC末端側半分はキナーゼドメインとして折りたたまれ、触媒活性を担います。このドメイン構造はc-RafとB-Rafで詳細に解明されており、他のRafキナーゼやKSR、MLKファミリーなどTKLグループの他のMAP3Kとも類似しています。TKLグループはチロシンキナーゼの特徴も一部持ちますが、基質リン酸化はセリン/スレオニン残基に限定されます。Rafキナーゼの最も重要な基質は、自身を除くとMEK1とMEK2であり、これらの活性はRafによるリン酸化に厳密に依存します。
進化と関連因子
ヒトが属する脊椎動物には、c-Rafの他にB-Raf、A-Rafという2つのRafキナーゼが存在し、大部分が共通のドメイン構成、構造、調節機構を持ちます。これらの遺伝子は、脊椎動物進化初期の遺伝子重複により単一の祖先型Raf遺伝子から生じたと考えられています。多くの他の動物はRafを1つだけ持ち、例えばショウジョウバエではPhlまたはDraf、線虫ではLin-45と呼ばれます。
多細胞動物にはまた、Rafと密接に関連するKSR（Kinase Suppressor of Ras）と呼ばれるキナーゼファミリーが存在します。哺乳類などの脊椎動物にはKSR1、KSR2の2つのパラログがあります。KSRのC末端キナーゼドメインはRafに酷似しますが、N末端調節領域は異なります。KSRもヒンジ領域やC1ドメイン（CA3）に類似する領域を持ちますが、Ras結合ドメインは欠如しています。代わりに、N末端にCA1、CA2という特有の調節領域を持ちます。CA1領域は2012年にCC-SAM（coiled-coil attached SAM）ドメイン構造であることが判明し、KSRの膜結合を補助すると考えられています。KSRもRafと同様にリン酸化依存的な14-3-3結合モチーフを持ちますが、ヒンジ領域にはさらにMAPK（ERK1/2）結合モチーフ（FxFP配列）が存在し、Rafキナーゼのフィードバック調節に関与します。KSRはRafと同じ経路に関わりますが、その内在キナーゼ活性は極めて弱く、MEKリン酸化への寄与は小さいです。KSRの主要な役割は、Rafのヘテロ二量体化を促進し、アロステリック機構によりRafの活性化を大きく高めることであると考えられています。
活性の調節
c-Rafの活性制御は非常に複雑で、ERK1/2経路の「ゲートキーパー」として、多数の阻害機構により制御され、通常は段階的な活性化を受けます。最も重要な調節は、N末端の自己阻害ブロック（CR1）とキナーゼドメイン間の物理的な相互作用です。この相互作用により触媒部位が閉鎖され、キナーゼ活性は停止します。この自己阻害は、Rafの自己阻害ドメインがRas（特にGTP結合型）のような競合するパートナーと結合したときに解除され、c-Rafはキナーゼ活性化に必要な「開いた」コンフォメーションに変化します。
14-3-3タンパク質も自己阻害に関与します。14-3-3は二量体を形成し、2つの結合部位でパートナーを一定の距離と配向に固定する「手錠」のように機能します。c-Rafの2つの14-3-3結合モチーフに14-3-3二量体が結合すると、c-Rafは自己阻害を促進し、自己阻害ドメインと触媒ドメインの乖離を許さないコンフォメーションに固定されます。この14-3-3による固定は、結合モチーフの特定のセリン残基（Ser259とSer621）のリン酸化によって制御されます。このリン酸化にはTAK1などが関与し、プロテインホスファターゼ1や2A複合体によって脱リン酸化されます。ただし、Rafが活性化されて二量体を形成した状態では、14-3-3は二量体間の橋渡しとして結合し、二量体の解離を防ぎ安定化に寄与するなど、必ずしも阻害的ではなく、他の結合様式も存在します。
二量体化もc-Raf活性調節の重要機構であり、特にRafの活性化ループのリン酸化に必要です。通常、「開いた」構造のキナーゼドメインを持つ分子が二量体を形成します。c-Rafのホモ二量体化や他の因子（KSRなど）とのヘテロ二量体化が起こります。
c-Rafが十分な活性を持ち、活性化状態が安定化されるためには、活性化ループのリン酸化が不可欠です。この役割を果たすのは、現在のところ主にRafファミリーキナーゼ自身（トランスリン酸化）ですが、PAK1などもキナーゼドメイン近傍の他の残基をリン酸化することが示唆されています。c-Rafの場合、活性化ループのトランスリン酸化にはc-Raf自身とKSR1の双方を含む二量体（あるいはより大きな複合体）が必要です。このリン酸化により、活性化ループは強固な構造をとり、脱リン酸化されるまでキナーゼドメインを完全活性化状態に固定します。リン酸化された活性化ループは自己阻害ドメインの存在に対しても非感受性となります。KSRは活性化ループにリン酸化を受ける残基を持たないため、この最終段階は起こりません。完全に活性化されたc-Rafは、自身の基質と結合・リン酸化します。主要な基質はMEK1とMEK2であり、これらがリン酸化されることで活性化され、下流のERK1/2を活性化します。活性化されたERKは核へ移行し、転写因子を活性化するなど、細胞周期、細胞移動、アポトーシス抑制、細胞分化に関わる遺伝子発現制御に重要な役割を果たします。
関係するヒトの疾患
c-Raf遺伝子の機能獲得型変異は稀ですが、いくつかの重篤な症候群に関与しています。これらの変異の多くは、14-3-3結合モチーフのいずれかに単一のアミノ酸置換が生じたものです。c-Rafの変異は、先天性心疾患、低身長、その他の奇形を伴うヌーナン症候群の原因の一つと考えられています。また、関連疾患であるLEOPARD症候群と呼ばれる複雑な欠陥症候群の原因ともなります。
がんにおける役割と治療標的
実験的にはc-Rafはがん遺伝子に変異する能力を示し、ヒトの少数腫瘍でも変異が見られますが、ヒトの発がんにおいて主要な役割を担っているのは、姉妹キナーゼであるB-Rafです。
B-Rafの変異
ヒト腫瘍試料の約20%でB-Raf遺伝子に変異が見られます。これらの変異の圧倒的多数はV600Eというアミノ酸置換です。この変異を持つBRAF-V600Eは、活性化ループのリン酸化を模倣し、正常な活性化制御を迂回してキナーゼドメインを常に活性化状態に保ちます。BRAF-V600Eはホモ二量体化またはc-Rafとのヘテロ二量体化を通じてc-Rafも活性化できるため、結果としてERK1/2経路が恒常的に活性化され、無制御な細胞増殖を引き起こします。
治療標的として
RasやB-Rafの変異は腫瘍形成に重要であることから、特にBRAF-V600E変異を標的としたRaf阻害剤ががん治療薬として開発されてきました。ソラフェニブが最初に臨床応用された薬剤であり、腎細胞がんや悪性黒色腫など、それまで治療が困難であったがんに新たな治療選択肢をもたらしました。ベムラフェニブ、レゴラフェニブ、ダブラフェニブなど、他の分子も開発されています。
ATP競合型のB-Raf阻害剤は、K-Ras変異を伴うがんにおいて望ましくない影響（逆説的活性化）を引き起こす可能性があります。これらの薬剤はB-Raf変異が主要因の場合にはB-Raf活性を効果的に阻害しますが、非変異のRaf遺伝子を持つがん、特に上流のK-Rasに変異がある場合、B-Rafのホモ二量体化やc-Rafとのヘテロ二量体化を促進することで、c-Rafの活性を阻害するのではなくむしろ高めてしまうことがあります。この「逆説的」なc-Raf活性化を避けるため、B-Raf阻害剤による治療を開始する前に、患者のB-Raf変異をスクリーニングすることが必須となっています。
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