RNA誘導サイレンシング複合体

RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）

RNA誘導サイレンシング複合体（英: RNA-induced silencing complex、略称: RISC）は、複数のタンパク質とRNA分子が結合した、細胞内で遺伝子の働きを制御する重要な分子装置です。リボヌクレオタンパク質の一種として知られ、遺伝子サイレンシングと呼ばれる現象において中心的な役割を担います。RISCは、マイクロRNA（miRNA）や短い干渉RNA（siRNA）といった特定のRNA断片をガイドとして利用し、遺伝子の発現を転写レベルおよび翻訳レベルで精密に調節しています。この複合体による遺伝子制御の仕組みは、RNA干渉（RNAi）として広く知られており、多くの真核生物に見られます。特に、二本鎖RNA（dsRNA）がRNAiの引き金となることから、ウイルス感染に対する細胞の防御応答機構としても機能しています。

発見の経緯

RISCの存在が分子生物学的に明らかにされたのは、コールド・スプリング・ハーバー研究所のグレゴリー・ハノンらの研究グループによるものです。これは、アンドリュー・ファイアーとクレイグ・メローが線虫においてRNA干渉を発見した1998年からわずか2年後のことでした。ハノンらは、ショウジョウバエ（Drosophila）の細胞を用いて、dsRNAによって引き起こされる遺伝子サイレンシングに関わるRNAi機構の構成要素を特定しようと試みました。

彼らはまず、ショウジョウバエのS2細胞に、lacZ遺伝子を発現させるベクターとlacZ遺伝子に対するdsRNAを導入し、β-ガラクトシダーゼという酵素の活性を測定しました。その結果、lacZのdsRNAを加えた細胞では、コントロールのdsRNAを加えた場合と比べてβ-ガラクトシダーゼの活性が著しく低下しました。これは、導入されたdsRNAが、その配列の相補性に基づいて特定の遺伝子の発現を抑制していることを示唆していました。

次に、細胞周期の進行に必須な因子であるサイクリンEをコードするdsRNAをS2細胞に導入する実験が行われました。すると、サイクリンEのdsRNAは細胞周期をS期に入る前のG1期で停止させました。この結果から、RNAiは細胞自身の内因性遺伝子も標的とすることができることが示されました。

さらに詳細な解析から、サイクリンEのdsRNAはサイクリンEのmRNA量のみを減少させることが判明しました。同様の配列特異的なmRNA量の低下は、別のサイクリンであるサイクリンAのdsRNAを用いた実験でも確認されました。これは、RNAiの特徴である、導入されたdsRNAに対応する標的mRNAのレベルが減少するという現象を示しています。

mRNA量の低下が、他の研究系で示唆されていたように、標的mRNAの直接的な分解によるものなのかを確かめるため、ハノンらはサイクリンEまたはlacZのdsRNAを導入したS2細胞に、対応する合成mRNAを加えて培養する実験を行いました。その結果、サイクリンEのdsRNAを導入した細胞でのみサイクリンEのmRNAが分解され、lacZのmRNAは安定でした。逆に、lacZのdsRNAを導入した細胞ではlacZのmRNAのみが分解され、サイクリンEのmRNAは安定でした。これらの実験結果に基づき、ハノンらはRNAi機構が配列特異的なヌクレアーゼ（核酸分解酵素）活性によって標的mRNAを分解していることを提唱し、そのヌクレアーゼ活性を担う複合体をRISCと名付けました。

RNA干渉機構における機能

RISCはRNA干渉の様々な段階で機能します。

siRNA/miRNAの取り込み

RNAiの最初のステップは、ガイドとなる短いRNA断片の準備です。RNase IIIファミリーに属するDicerという酵素は、長い二本鎖RNAや、ヘアピン構造をとるpre-miRNAを、21〜23ヌクレオチド長の短い二本鎖断片（siRNAまたはmiRNA）に切断します。これらの短いRNA断片がRISCにロードされます。この際、「asymmetry rule」と呼ばれる現象に基づき、二本鎖RNAの一方の鎖がガイド鎖として選ばれます。通常、熱力学的に5'末端側の安定性が低い方の鎖がArgonauteタンパク質に取り込まれてガイド鎖となり、もう一方の鎖（パッセンジャー鎖）はRISCによって分解されます。

遺伝子発現の調節

RISCは、選ばれたガイド鎖RNAを用いて標的となるmRNAを細胞内で探索します。ガイド鎖は、ワトソン・クリック型の塩基対形成によって、主に標的mRNAの3'非翻訳領域（3' UTR）にある相補的な配列を認識し結合します。この結合により、RISCは様々な方法で標的mRNAからの遺伝子発現を調節することが可能となります。

mRNAの分解

RISCの最もよく知られた機能の一つは、標的mRNAを分解することです。これにより、リボソームによる翻訳に利用できるmRNAの量が減少し、タンパク質の合成が抑制されます。RISCを構成するArgonauteタンパク質は、ガイド鎖に厳密に相補的な配列を持つ標的mRNAをエンドヌクレアーゼとして切断します。このArgonauteによる「スライサー（slicer）」活性は、mRNA分解によるRNAiの開始に不可欠です。mRNAの切断が起こるためには、ガイド鎖と標的mRNA配列のほぼ完全な相補性と、Argonauteタンパク質にスライサー活性があることの二つが重要な要件となります。

mRNAが切断された後の分解には、主に二つの経路があります。どちらの経路も、まずmRNAのポリ(A)テールの分解から始まり、その後5'キャップの除去が行われます。

転写産物が5'末端から3'末端方向へ分解される経路は、細胞質内のP-bodyと呼ばれる構造体で行われ、XRN1というエキソヌクレアーゼが関与します。
転写産物が3'末端から5'末端方向へ分解される経路には、エキソソーム複合体やSki複合体が関与します。

翻訳抑制

RISCは、標的mRNAへの結合を介して、リボソームや翻訳に必要な補助因子の結合を調節し、翻訳そのものを抑制することも可能です。mRNAの分解とは異なり、翻訳抑制の場合、ガイド鎖と標的mRNAの配列相補性は部分的なものでも機能することが多いです。

翻訳抑制は、翻訳開始段階と開始後段階の両方で起こり得ますが、詳細なメカニズムはまだ完全には解明されていません。

翻訳開始段階での調節: mRNAの5'キャップへの真核生物型翻訳開始因子（eIF）の結合を阻害することが報告されています。また、RISCがmRNAの3'側のポリ(A)テールを短くすることで、5'キャップを介した翻訳抑制に関与する可能性も示唆されています。さらに、リボソームの60SサブユニットがmRNAに結合するのを阻害することで翻訳を抑制することも知られています。
翻訳開始後段階での調節: 翻訳が開始された後、ペプチド鎖の分解を促進したり、翻訳中のリボソームがmRNA上で早期に停止したり、伸長反応が遅延したりすることが報告されています。これらの開始後段階での抑制機構の詳細や、開始段階での抑制との関係については、さらなる研究が必要です。

ヘテロクロマチン形成

一部のRISC複合体は、細胞のゲノムDNAを直接的に標的とし、遺伝子の転写を抑制する働きも持っています。このようなRISCは、RNA誘導転写サイレンシング（RITS）複合体として知られています。RITSは特定の遺伝子座にヒストンメチルトランスフェラーゼなどのエピジェネティック修飾酵素をリクルートすることで、その領域にヘテロクロマチンと呼ばれる構造を形成させ、遺伝子をサイレンシングします。この機能は、特に酵母のRITSで詳しく研究されています。

RITSは、セントロメア領域のような特定の反復配列を認識し、その領域にヘテロクロマチンを形成する指示を与えます。ガイド鎖siRNAが、その領域から転写されたばかりの新生RNAと塩基対を形成することで、RITS複合体やヒストン修飾酵素が特定の染色体領域に引き寄せられると考えられています。RITSはまた、この新生mRNA転写産物を分解する活性も持ちますが、その詳しい機構は不明です。興味深いことに、分解された新生転写産物がRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）によって増幅され、より多くのsiRNAが作られるという自己増幅的なフィードバックループが存在することも示唆されています。

分裂酵母やシロイヌナズナでは、Dicerによって作られたdsRNA由来のsiRNAが、ヘテロクロマチン形成による遺伝子サイレンシング経路の開始点となります。Argonauteタンパク質の一種であるAGO4は、ヘテロクロマチン領域を特徴づける短いRNAと相互作用します。ヒストンメチルトランスフェラーゼは、ヒストンH3の特定の部位（H3K9）をメチル化し、このメチル化された部位にクロモドメインを持つタンパク質をリクルートします。一度ヘテロクロマチンが確立され拡大すると、DNAのメチル化によってそのサイレンシング状態が維持されます。

DNAの除去

繊毛虫の一種であるテトラヒメナにおいては、RISCによって生成されたsiRNAが、体細胞の核（大核）が形成される過程で特定のDNA配列を除去する役割を持つことが示されています。この機構は、上記のヘテロクロマチン形成機構と類似しており、細胞に侵入してきた外来性の遺伝因子に対する防御としても機能する可能性が示唆されています。

分裂酵母やシロイヌナズナにおけるヘテロクロマチン形成と同様に、テトラヒメナでもArgonauteファミリーのTwi1pというタンパク質が、内部除去配列（internal elimination sequence; IES）と呼ばれる標的DNA配列の除去を触媒します。メチルトランスフェラーゼやクロモドメインタンパク質の作用によってIES領域がヘテロクロマチン化され、その後DNAから切り出されて除去されると考えられています。

RISC関連タンパク質

RISCの正確な構造や構成要素は、まだ完全には解明されていません。様々な研究によってRISCのサイズや含まれるタンパク質に関する報告が異なっていますが、これは細胞内に複数の異なるRISC複合体が存在するためなのか、あるいは研究ごとに異なる細胞や組織から精製が行われているためなのかは明らかになっていません。

RISCの主要な構成要素や関連するタンパク質として、以下のものが知られています。

Argonaute (Ago) タンパク質: 原核生物から真核生物まで広く存在するタンパク質ファミリーです。真核生物においてはRNAi機構に不可欠な役割を果たします。ヒトでは8種類のArgonauteメンバーが存在しますが、ガイドRNAに相補的な標的RNAを切断する「スライサー」活性を持つのはAgo2のみです。
RISCローディング複合体 (RLC): dsRNAを成熟したRISC複合体へ効率的に受け渡すために必要不可欠な複数のタンパク質からなる構造体です。RLCには、Dicer、TRBP、そしてArgonaute2（Ago2）が含まれます。DicerはRNAiを開始するための短いdsRNA断片を生成し、TRBPはdsRNAと結合する能力を持ち、Ago2はRISCの触媒中心として機能します。DicerとTRBP、Ago2の相互作用は、Dicerが切り出したdsRNAをAgo2へスムーズに受け渡すことを促進します。ヒトにおいては、DHX9というタンパク質もRLCの機能を助けることが示されています。
* その他のタンパク質: 近年、SND1やMTDHといったタンパク質もRISCのメンバーとして同定されています。これらのタンパク質はがん遺伝子としても知られており、様々な遺伝子の発現調節に関与しています。

mRNA標的への結合メカニズム

活性化されたRISC複合体がどのようにして細胞内の膨大なmRNAの中から特定の標的mRNAを見つけ出すのかについては、まだ未解明な点が多いです。興味深いことに、この標的探索と結合の過程は、細胞内でmRNAからタンパク質への翻訳が行われていない状況でも進行することが示されています。

後生動物（動物）において内因的に発現しているmiRNAは、多くの場合、標的mRNAの配列と完全に相補的ではなく、部分的な相補性で結合します。このような不完全な相補性を持つ結合は、主に翻訳抑制を介して複数の遺伝子発現を調節するために利用されます。一方、植物におけるmiRNAの機能は、標的mRNAに対してより高い配列特異性を示す傾向があり、通常、各miRNAはほぼ一つの種類のmRNAと厳密に結合します。このような高い特異性を持つ結合は、標的mRNAの効率的な分解を引き起こしやすいと考えられています。

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